Synthese van een inteïne gemedieerde Kunstmatige Protein Hydrogel
Summary
We presenteren de synthese van een split-inteïne gemedieerde proteïne hydrogel. De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten copolymeren elk een subeenheid van een trimere eiwit dat fungeert als een verknopingsmiddel en een helft van een gespleten intein. Menging van de twee copolymeren eiwit activeert een inteïne trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid die zelf-assembleert een hydrogel. Deze hydrogel is zeer pH-en temperatuur-stabiele compatibel met organische oplosmiddelen en gemakkelijk bevat functionele globulaire eiwitten.
Abstract
We presenteren de synthese van zeer stabiele eiwit hydrogel gemedieerd door een split-inteïne gekatalyseerde eiwit trans-splicing reactie. De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten blokcopolymeren elk een subeenheid van een trimere eiwit dat fungeert als een verknopingsmiddel en een helft van een gespleten intein. Een sterk hydrofiel willekeurige spoel wordt ingebracht in een van de blok-copolymeren voor waterretentie. Menging van de twee eiwitten blokcopolymeren activeert een inteïne trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid met verknopingsmiddelen aan beide uiteinden die snel zelf-assembleert een hydrogel. Deze hydrogel is zeer stabiel onder zowel zure als basische omstandigheden, bij temperaturen tot 50 ° C en in organische oplosmiddelen. De hydrogel snel hervormingen na-afschuiving veroorzaakte breuk. Oprichting van een "docking station peptide" in de hydrogel bouwsteen maakt handig integreren van "docking eiwit"-gelabeld doelwit eiwitten.De hydrogel is compatibel met weefselgroei kweekmedia, ondersteunt de diffusie van 20 kDa moleculen en maakt de immobilisatie van biologisch actieve globulaire eiwitten. De toepassing van het inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel als een organisch-oplosmiddel-compatibele biokatalysator werd gedemonstreerd door inkapseling van het mierikswortel peroxidase enzym en bevestigende zijn activiteit.
Introduction
Hydrogelen geheel gemaakt van eiwitten dragen het potentieel om uiteenlopende gebieden als tissue engineering, drug delivery en biofabrication 1 aanzienlijke vooruitgang. Zij bieden voordelen ten opzichte van traditionele synthetische polymeren hydrogels zoals biocompatibiliteit en potentieel invasief ondersteunen de opname van bioactieve globulaire eiwitten.
In dit werk beschrijven we de ontwikkeling van een nieuw eiwit hydrogel gevormd via een split-inteïne-eiwit gemedieerde trans-splicing reactie en de toepassing ervan als een eiwit immobilisatie steiger (figuur 1). De bouwstenen van deze hydrogel twee eiwitten blokcopolymeren die elk de N-of C-terminale fragment van een split inteïne (IN en IC) en een subeenheid van een multimeer proteïne crosslinker. De inteïne DnaE van Nostoc punctiforme (NPU) werd gebruikt als de splitsing intein 2,3 en een kleine trimere eiwit (12 kDa) Cuta van Pyrococcus horikoshii </ Em> werd als crosslinker eiwit 4,5. Verschillende verknopingsmiddelen zijn verbonden door intein gekatalyseerde trans-splicing reactie leidt tot de vorming van een sterk verknoopte proteïnenetwerk (hydrogel). NPU intein werd gekozen vanwege de snelle reactiekinetiek (t1 / 2 = 63 sec) en hoge trans-splicing opbrengst (bijna 80%) 2,3. De Cuta eiwit werd gekozen als crosslinker vanwege zijn hoge stabiliteit. Cuta trimeren een denaturatie temperatuur dichtbij 150 ° C en bewaar trimere quaternaire structuur in oplossingen die zoveel 5 M guanidine hydrochloride 4,6. Aangezien subeenheid uitwisseling tussen verschillende verknopingsmiddelen is een belangrijke bijdrage van de oppervlakte fysieke hydrogel erosie 7, dient de sterke inter-subeenheid interactie Cuta dergelijke subeenheid uitwisseling ontmoedigen, waardoor een stabielere hydrogel. Een van deze bouwstenen bevat ook een sterk hydrofiel peptide S-fragment als het midden-blok naar water gemakkelijkretentie 8.
Menging van de twee hydrogel bouwstenen initieert een trans-splicing reactie tussen de IN en IC intein fragmenten, waardoor een langere polypeptideketen met verknopingsmiddelen aan beide terminals. Crosslinkers van meerdere dergelijke moleculaire eenheden met elkaar, waarbij een zeer verknoopte hydrogel netwerk (figuur 1A). Een specifiek "docking station peptide" (DSP) is opgenomen in een van de hydrogel bouwstenen stabiele immobilisatie van een "docking eiwit" (DP)-gemerkt doeleiwit in de hydrogel vergemakkelijken. Het gebruik van een split inteïne de hydrogel samenstel bemiddelen niet alleen extra flexibiliteit hydrogel proteïne synthese, maar ook zorgt voor een hoge dichtheid, gelijkmatige belasting van het doeleiwit de gehele hydrogel, als doeleiwitten worden geladen voordat hydrogelvorming.
De intein gemedieerde proteïne hydrogel zeer staBLE in waterige oplossing met weinig tot geen detecteerbare erosie na 3 maanden bij kamertemperatuur. Stabiliteit wordt vastgehouden in een breed scala van pH (6-10) en temperatuur (4-50 ° C), en de hydrogel is ook compatibel met organische oplosmiddelen. Deze hydrogel wordt gebruikt voor de immobilisatie van twee globulaire eiwitten: green fluorescent protein (GFP) en mierikswortelperoxidase (HRP). Hydrogel invangen deze proteïne om biokatalyse uitgevoerd in een organisch oplosmiddel.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk hebben we aangetoond de synthese van een zeer stabiele inteïne-gemedieerde proteïne hydrogel. Gebruik van een split intein kan de hydrogel voorwaardelijk worden gevormd als reactie op het mengen van twee vloeibare-fasecomponenten. Met name de splitsing intein covalent twee vloeibare fasen bouwstenen via een trans-splicing reactie, waarbij een polypeptide eenheid geflankeerd door verknoping eenheden die weer zelf assembleert een hydrogel. Het mengen geïnduceerde vorming van de hydrogel omzeilt tec…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr David Tirrell (Caltech) erkennen voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pQE9 AC 10 ATRP 12, dr. Tom Muir (Princeton universiteit) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japan) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pET30-Cuta-Tip1 10, en Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) voor zijn vriendelijke gift van het plasmide pJD757 13 . Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation LOOPBAAN, US Air Force YIP en Norman Hackman Geavanceerde onderzoeksprogramma.
Materials
|
Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
|
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
|
kanamycin sulfate |
VWR |
||
|
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
|
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
|
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
|
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
|
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
| [header] | |||
|
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |
References
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochimie. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C.. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
