एक Intein की मध्यस्थता कृत्रिम प्रोटीन hydrogel के संश्लेषण
Summary
हम एक विभाजन intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल का संश्लेषण प्रस्तुत करते हैं. इस हाइड्रोजेल की इमारत ब्लॉकों प्रत्येक एक विभाजन intein की एक crosslinker और एक आधे के रूप में कार्य करता है कि एक Trimeric प्रोटीन की एक सबयूनिट युक्त दो प्रोटीन सहपॉलिमरों हैं. दो प्रोटीन सहपॉलिमरों का मिश्रण हाइड्रोजेल में है कि स्वयं assembles एक पॉलीपेप्टाइड इकाई उपज, एक intein पार splicing प्रतिक्रिया से चलाता है. यह हाइड्रोजेल अत्यधिक पीएच और तापमान स्थिर, कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ संगत है, और आसानी से कार्यात्मक गोलाकार प्रोटीन को शामिल किया गया है.
Abstract
हम एक विभाजन intein उत्प्रेरित प्रोटीन पार splicing प्रतिक्रिया द्वारा मध्यस्थता एक अत्यधिक स्थिर प्रोटीन हाइड्रोजेल का संश्लेषण प्रस्तुत करते हैं. इस हाइड्रोजेल की इमारत ब्लॉकों प्रत्येक एक विभाजन intein की एक crosslinker और एक आधे के रूप में कार्य करता है कि एक Trimeric प्रोटीन की एक सबयूनिट युक्त दो प्रोटीन ब्लॉक सहपॉलिमरों हैं. एक अत्यधिक हाइड्रोफिलिक यादृच्छिक कुंडल पानी बनाए रखने के लिए ब्लॉक सहपॉलिमरों में से एक में डाला जाता है. दो प्रोटीन ब्लॉक copolymers का मिश्रण दोनों छोर पर crosslinkers साथ एक पॉलीपेप्टाइड इकाई उपज, एक intein पार splicing प्रतिक्रिया से चलाता है कि एक हाइड्रोजेल में तेजी से स्वयं assembles. यह हाइड्रोजेल 50 डिग्री सेल्सियस तक, और कार्बनिक विलायकों में तापमान पर, दोनों अम्लीय और बुनियादी परिस्थितियों में बहुत ही स्थिर है. कतरनी प्रेरित टूटना के बाद हाइड्रोजेल तेजी से सुधारों. हाइड्रोजेल निर्माण खंड में एक "डॉकिंग स्टेशन पेप्टाइड" का समावेश "डॉकिंग प्रोटीन" टैग लक्ष्य प्रोटीन की सुविधाजनक समावेश सक्षम बनाता है.हाइड्रोजेल, टिशू कल्चर विकास मीडिया के साथ संगत है 20 केडीए अणुओं के प्रसार का समर्थन करता है, और bioactive गोलाकार प्रोटीन की स्थिरीकरण में सक्षम बनाता है. एक कार्बनिक विलायक संगत biocatalyst रूप intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल का आवेदन हॉर्सरैडिश peroxidase एंजाइम encapsulating और अपनी गतिविधि corroborating द्वारा प्रदर्शन किया गया.
Introduction
प्रोटीन की पूरी तरह से बनाया hydrogels काफी ऊतक इंजीनियरिंग, दवा वितरण और biofabrication 1 के रूप में विविध क्षेत्रों अग्रिम करने की क्षमता ले. वे biocompatibility और noninvasively bioactive गोलाकार प्रोटीन का समावेश का समर्थन करने की क्षमता सहित पारंपरिक सिंथेटिक बहुलक हाइड्रोजेल अधिक लाभ प्रदान करते हैं.
इस काम में, हम एक प्रोटीन स्थिरीकरण पाड़ के रूप में एक विभाजन intein की मध्यस्थता प्रोटीन पार splicing प्रतिक्रिया और अपने आवेदन (चित्रा 1) के माध्यम से गठित एक उपन्यास प्रोटीन hydrogel के विकास का वर्णन. इस हाइड्रोजेल के लिए इमारत ब्लॉकों प्रत्येक (और आईसी) intein एक विभाजन और एक multimeric crosslinker प्रोटीन की एक सबयूनिट के एन या सी टर्मिनल टुकड़ा जिसमें दो प्रोटीन ब्लॉक सहपॉलिमरों हैं. Intein नोस्टॉक punctiforme (NPU) से DnaE 2,3 intein विभाजन और एक छोटे प्रोटीन trimeric Pyrococcus से (12 केडीए) CutA horikoshii <रूप में इस्तेमाल किया गया था/ उन्हें> crosslinker प्रोटीन 4,5 के रूप में इस्तेमाल किया गया था. विभिन्न crosslinkers एक अत्यधिक Crosslinked प्रोटीन नेटवर्क (हाइड्रोजेल) के गठन के लिए अग्रणी intein उत्प्रेरित पार splicing प्रतिक्रिया के माध्यम से शामिल हो गए हैं. NPU intein क्योंकि अपनी तेजी से प्रतिक्रिया कैनेटीक्स (टी 1/2 = 63 सेकंड) और उच्च पार splicing उपज (करीब 80%) 2,3 के लिए चुना गया था. CutA प्रोटीन इसकी उच्च स्थिरता की वजह से crosslinker के रूप में चुना गया था. CutA trimers के पास 150 डिग्री सेल्सियस के विकृतीकरण तापमान है और जितना एम 5 के रूप में guanidine हाइड्रोक्लोराइड 4,6 युक्त समाधान में trimeric चतुर्धातुक संरचना बरकरार रहती है. विभिन्न crosslinkers के बीच सबयूनिट विनिमय शारीरिक हाइड्रोजेल सतह कटाव 7 के एक प्रमुख योगदानकर्ता है, CutA में बहुत मजबूत इंटर सबयूनिट बातचीत के लिए एक अधिक स्थिर हाइड्रोजेल के लिए अग्रणी, ऐसे सबयूनिट एक्सचेंजों को हतोत्साहित करना चाहिए. इन इमारत ब्लॉकों में से एक भी पानी की सुविधा के लिए मध्य ब्लॉक के रूप में एक अत्यधिक हाइड्रोफिलिक पेप्टाइड एस टुकड़ा होता हैअवधारण 8.
दो हाइड्रोजेल इमारत ब्लॉकों का मिश्रण दोनों टर्मिनलों पर crosslinkers साथ एक लंबे समय तक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला पैदा करने, टुकड़े intein में और आईसी के बीच एक पार splicing प्रतिक्रिया आरंभ करता है. कई ऐसे आणविक इकाइयों से crosslinkers एक अत्यधिक Crosslinked हाइड्रोजेल नेटवर्क (चित्रा 1 ए) के गठन, एक दूसरे के साथ बातचीत. एक विशिष्ट "डॉकिंग स्टेशन पेप्टाइड" (डीएसपी) एक "डॉकिंग प्रोटीन" (डीपी) टैग हाइड्रोजेल में लक्ष्य प्रोटीन की स्थिर स्थिरीकरण की सुविधा के लिए हाइड्रोजेल इमारत ब्लॉकों में से एक में शामिल किया है. हाइड्रोजेल विधानसभा मध्यस्थता intein एक विभाजन का उपयोग लक्ष्य प्रोटीन पूर्व हाइड्रोजेल गठन के लिए लोड कर रहे हैं, के रूप में प्रोटीन हाइड्रोजेल संश्लेषण के लिए अतिरिक्त लचीलापन प्रदान करता है, लेकिन यह भी पूरी हाइड्रोजेल भर में लक्ष्य प्रोटीन की उच्च घनत्व, वर्दी लदान के लिए सक्षम बनाता ही नहीं.
intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल अत्यधिक स्टेशन हैसाथ जलीय घोल में ble छोटे से कोई कमरे के तापमान पर 3 महीने के बाद detectable कटाव. स्थिरता PHS (6-10) और तापमान (4-50 डिग्री सेल्सियस) की एक विस्तृत श्रृंखला में बनाए रखा, और हाइड्रोजेल भी कार्बनिक विलायकों के साथ संगत है. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी): यह हाइड्रोजेल दो गोलाकार प्रोटीन का स्थिरीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है. उत्तरार्द्ध प्रोटीन entrapping हाइड्रोजेल एक कार्बनिक विलायक में Biocatalysis प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में, हम एक अत्यधिक स्थिर intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल का संश्लेषण का प्रदर्शन किया. एक विभाजन का उपयोग intein सशर्त दो तरल चरण घटकों के मिश्रण के जवाब में गठन किया जाना हाइड्रोजेल सक्षम बनाता ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों, प्लाज्मिड KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11 के अपने तरह का उपहार के लिए प्लाज्मिड की अपनी तरह का उपहार pQE9 एसी 10 ATRP 12, डा. टॉम मुइर (प्रिंसटन विश्वविद्यालय) के लिए डॉ. डेविड Tirrell (कैलटेक) स्वीकार करना चाहते हैं प्लाज्मिड की अपनी तरह का उपहार pJD757 13 के लिए प्लाज्मिड pET30-CutA-Tip1 10, और डॉ. जे डी Keasling (यूसी बर्कली) के अपने तरह का उपहार के लिए डा. तकेहिसा मत्सुदा (प्रौद्योगिकी, Hakusan, इशिकावा, जापान के कानाज़ावा संस्थान) . यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर, अमेरिकी वायु सेना भौंकना और नॉर्मन हैकमैन एडवांस्ड रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
|
Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
|
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
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|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
|
kanamycin sulfate |
VWR |
||
|
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
|
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
|
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
|
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
|
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
| [header] | |||
|
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
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|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |
References
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