Синтез интеин-опосредованной искусственного белка гидрогеля
Summary
Мы представляем синтез сплит-интеин опосредованного белка гидрогеля. Строительные блоки этом гидрогель две белковые Сополимеры каждая из которых содержит субъединицу тримерного белка, который служит в качестве сшивающего агента и одной половине разделенной интеина. Смешивание двух сополимеров белка вызывает интеин реакцию транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок, объединяющаяся в гидрогеля. Этот гидрогель весьма рН и температуры стабильной, совместимый с органическими растворителями, и легко включает в себя функциональные глобулярных белков.
Abstract
Мы представляем синтез высокостабильного гидрогеля белка при посредничестве сплит-интеин катализируемой белком реакции транс-сплайсинга. Строительные блоки этом гидрогель две белковые блок-сополимеры, содержащие каждый субъединицу тримерного белок, который служит в качестве сшивающего агента и одной половине разделенной интеина. Высоко гидрофильный статистического клубка вставлен в один из блок-сополимеров для удержания воды. Смешение двух блочных белок сополимеров вызывает интеин реакцию транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок с сшивателей с обоих концов, что быстро объединяющаяся в гидрогеля. Этот гидрогель является очень стабильным при обеих кислотных и основных условиях, при температурах до 50 ° C, и в органических растворителях. Гидрогелевые быстро реформы после разрыва сдвига, вызванных. Включение в "Док-станция для пептида" в гидрогель строительного блока позволяет удобно включение «стыковки белка"-меченых белков-мишеней.Гидрогель совместим с роста среды культуры ткани, поддерживает диффузию молекул 20 кДа, и дает возможность иммобилизации биологически активных глобулярных белков. Применение интеин-опосредованного белком гидрогеля в качестве органического растворителя, совместимого биокатализатора была продемонстрирована путем инкапсуляции пероксидаза хрена фермента и подтверждающих его активность.
Introduction
Гидрогели, сделанные полностью из белков нести потенциал, чтобы значительно продвинуться таких различных областях, как тканевой инженерии, доставки лекарств и biofabrication 1. Они предлагают преимущества перед традиционными синтетические полимерные гидрогели включая биосовместимости и потенциал для неинвазивного поддержки включения биологически активных глобулярных белков.
В этой работе мы описываем развитие нового белка гидрогеля, образованного с помощью сплит-интеин опосредованного белка реакции транс-сплайсинга и его применение в качестве белка иммобилизации эшафот (рис. 1). Строительные блоки для этой гидрогеля два белка блок-сополимеры каждая из которых включает N-или С-концевой фрагмент раскола интеин (в и IC) и субъединицы мультимерного белка сшивателя. DnaE интеин от Nostoc punctiforme (НПУ) использовали в качестве раскола интеина 2,3 и небольшой тримера белка (12 кДа) CutA от Pyrococcus horikoshii </ EM> был использован в качестве сшивающего агента белка 4,5. Различные сшивающие агенты соединены через интеин катализируемой реакции транс-сплайсинга, что приводит к образованию высоко сшитого белкового (гидрогель). НПУ интеин был выбран из-за его быстро кинетики реакции (T 1/2 = 63 сек) и высоким выходом транс-сплайсинга (близко к 80%) 2,3. Белок CutA был выбран в качестве сшивающего агента из-за его высокой стабильности. CutA тримеры иметь температуру денатурации ближайшем 150 ° С и удерживать тримерную структуру четвертичного в растворах, содержащих целых 5 М гуанидина гидрохлорид 4,6. С субъединицы обмен между различными сшивателей является одной из основных причин физического гидрогеля эрозии поверхности 7, очень сильное взаимодействие взаимодействие субъединицы в CutA должны препятствовать такие обмены субъединиц, что приводит к более стабильной гидрогеля. Один из этих блоков содержит также высоко гидрофильный пептид S-фрагмент в качестве середине блока, чтобы облегчить водуУдержание 8.
Смешивание двух строительных блоков гидрогель инициирует реакцию транс-сплайсинга между IN и IC интеин фрагментов, создавая более длительный полипептидную цепь с сшивающими агентами на обоих терминалах. Сшивающие агенты из нескольких таких молекулярных единиц взаимодействуют друг с другом, образуя высоко сшитого сети гидрогеля (рис. 1А). Конкретный "док-станцией пептид" (DSP) включен в один из гидрогеля строительных блоков для облегчения стабильного иммобилизации "док" белка (DP)-меченый белок-мишень в гидрогеле. Использование раскола интеин опосредовать сборку гидрогеля не только обеспечивает дополнительную гибкость для синтеза белка гидрогель, но также обеспечивает высокую плотность, равномерную загрузку целевого белка в течение всего гидрогеля, как целевые белки загружены до образования гидрогеля.
Белок гидрогель интеин опосредованного весьма станцииBLE в водном растворе с небольшим до исключения любых эрозии после 3 месяцев при комнатной температуре. Стабильность сохраняется в широком диапазоне рН (6-10) и температурах (4-50 ° С), а гидрогель также совместим с органическими растворителями. Этот гидрогель используется для иммобилизации двух глобулярных белков: зеленый флуоресцентный белок (GFP) и пероксидазы хрена (HRP). Гидрогель улавливания последний белок используется для выполнения Биокатализ в органическом растворителе.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе мы показали, синтез высокостабильного интеин-опосредованной белка гидрогеля. Использование раскола интеин позволяет гидрогель быть условно образованный в ответ на смешении двух жидкофазных компонентов. В частности, раскол интеин ковалентно связывает два жидкофазных с?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность д-р Дэвид Tirrell (Caltech) за его любезное дар плазмиды pQE9 переменного тока 10 ATRP 12, доктор Том Мьюир (Принстонский университет) за его любезное дар плазмиды KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Доктор Такэхиса Мацуда (Канадзава технологический институт, Хакусан, Исикава, Япония) за его любезное дар плазмиды pET30-CutA-Tip1 10, и д-р Джей Д. Keasling (UC Berkley) за его любезную дар плазмиды pJD757 13 . Эта работа была частично поддержана Национальным научным фондом карьеры, ВВС США Ип и программы Норман Hackman Advanced Research.
Materials
|
Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
|
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
|
kanamycin sulfate |
VWR |
||
|
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
|
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
|
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
|
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
|
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
| [header] | |||
|
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |
References
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochimie. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C.. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
