Syntes av ett intein medierad Artificiell Protein Hydrogel
Summary
Vi presenterar syntesen av en split-intein-medierad protein hydrogel. Byggstenarna i denna hydrogel är två protein sampolymerer vardera innehållande en subenhet av en trimer protein som fungerar som ett tvärbindningsmedel och en halv av ett delat intein. Blandning av de två protein sampolymerer utlöser ett intein transsplitsreaktionen, vilket ger en polypeptid-enhet som själv monterar in i en hydrogel. Denna hydrogel är starkt pH-och temperaturstabila, kompatibla med organiska lösningsmedel och lätt inkorporerar funktionella globulära proteiner.
Abstract
Vi presenterar syntes av en mycket stabil protein hydrogel förmedlas av en split-intein-katalyserad protein transsplitsreaktion. Byggstenarna i denna hydrogel är två protein segmentsampolymerer vardera innehållande en subenhet av en trimer protein som fungerar som ett tvärbindningsmedel och en halv av ett delat intein. En starkt hydrofil slumpmässig spole är införd i en av de block-sampolymerer för vätskeansamling. Blandning av de två protein segmentsampolymerer utlöser ett intein transsplitsreaktionen, vilket ger en polypeptid enhet med tvärbindningsmedel vid varje ände som snabbt själv monterar in i en hydrogel. Denna hydrogel är mycket stabil under både sura och basiska förhållanden, vid temperaturer upp till 50 ° C, och i organiska lösningsmedel. Den hydrogel snabbt reformer efter skjuvning-inducerad bristning. Införande av en "dockningsstation peptid" i hydrogel byggsten möjliggör bekväm inkorporering av "dockningsprotein"-märkta målproteiner.Hydrogelen är kompatibelt med vävnadsodlingstillväxtmedium, stödjer diffusionen av 20 kDa molekyler och möjliggör immobilisering av bioaktiva globulära proteiner. Tillämpningen av det införmedlade protein hydrogel som ett organiskt lösningsmedel som passar biokatalysator demonstrerades genom inkapsling av pepparrotsperoxidas-enzym och bekräftande dess aktivitet.
Introduction
Hydrogeler helt i proteiner bär potential att avsevärt avancera så skilda områden som vävnadsteknik, drug delivery och biofabrication 1. De erbjuder fördelar jämfört med traditionella syntetiska polymer hydrogel inklusive biokompatibilitet och potential att noninvasively stödja införlivandet av bioaktiva klotformiga proteiner.
I detta arbete beskriver vi utvecklingen av ett nytt protein hydrogel som bildas via en split-intein-medierad protein transsplitsreaktionen och dess tillämpning som ett protein immobilisering byggnadsställning (figur 1). Byggstenarna för denna hydrogel är två protein segmentsampolymerer vardera innefattande den N-eller C-terminalt fragment av ett delat intein (IN och IC) och en underenhet av ett multimert tvärbindningsprotein. Den DnaE intein från Nostoc punctiforme (NPU) användes som den delat intein 2,3 och en liten trimer-proteinet (12 kDa) CutA från Pyrococcus horikoshii </ Em> användes som tvärbindningsprotein 4,5. Olika tvärbindningsmedel är förenade genom intein katalyserad transsplitsreaktionen, vilket leder till bildandet av en högt tvärbundet proteinnätverk (hydrogel). NPU intein valdes på grund av dess snabba reaktionskinetik (t 1/2 = 63 sek) och hög trans-splits avkastning (nära 80%) 2,3. Den CutA proteinet valdes som tvärbindare grund av dess höga stabilitet. CutA trimerer ha en denatureringstemperatur av nära 150 ° C och behålla trimera kvaternär struktur i lösningar innehållande så mycket som 5 M guanidinhydroklorid 4,6. Eftersom subenhet utbyte mellan olika tvärbindnings är en viktig bidragsgivare i den fysiska hydrogel yterosion 7, bör den mycket starka bland subenheten interaktion i CutA avskräcka sådana subenheten börser, vilket leder till en mer stabil hydrogel. En av dessa byggstenar innehåller också en starkt hydrofil peptid S-fragment som mitten av blocket för att underlätta vattenretentionstid 8.
Blandning av två hydrogel byggblock initierar en transsplitsreaktionen mellan IN och IC intein fragment, generera en längre polypeptidkedja med tvärbindningsmedel vid båda terminalerna. Tvärbindningsmedel från flera sådana molekylära enheter interagerar med varandra, bildar en mycket tvärbunden hydrogel nätverk (Figur 1A). En specifik "dockningsstation peptid" (DSP) är inkorporerad i en av de hydrogel byggstenar för att underlätta stabil immobilisering av en "dockningsprotein" (DP)-märkt målproteinet i hydrogelen. Användningen av ett delat intein mediera hydrogelen aggregatet inte bara ger ytterligare flexibilitet med avseende på protein hydrogel syntes, utan möjliggör även hög densitet, likformig belastning av målproteinet genom hela hydrogelen, som målproteinerna lastas före hydrogel-bildning.
Den inteinförmedlade protein hydrogelen är mycket staligt i vattenlösning med lite till ingen detekterbar erosion efter 3 månader vid rumstemperatur. Stabilitet kvarhålles i en mängd olika pH-värden (6-10) och temperaturer (4-50 ° C), och hydrogelen är också kompatibla med organiska lösningsmedel. Denna hydrogel används för immobilisering av två globulära proteiner: det grönt fluorescerande protein (GFP) och pepparrotsperoxidas (HRP). Hydrogel infånga det senare proteinet används för att utföra biokatalys i ett organiskt lösningsmedel.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete visade vi syntesen av ett mycket stabilt införmedlade protein hydrogel. Användningen av ett delat möjliggör intein hydrogelen vara villkor bildad som svar på den blandning av två flytande-fas-komponenter. Specifikt uppdelningen länkar intein kovalent två flytande fas byggstenar via en transsplitsreaktion, vilket ger en polypeptid enhet flankerad av tvärbindning enheter som i sin tur själv monterar in i en hydrogel. Blandnings-inducerad bildning av hydrogelen kringgår tekniska svårighe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för Dr David Tirrell (Caltech) för hans vänliga gåva av plasmiden pQE9 AC 10 ATRP 12, Dr Tom Muir (Princeton University) för hans vänliga gåva av plasmiden KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japan) för hans vänliga gåva av plasmiden pET30-CutA-Tip1 10, och Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) för hans vänliga gåva av plasmiden pJD757 13 . Detta arbete stöddes delvis av National Science Foundation KARRIÄR, US Air force YIP och Norman Hackman Advanced Research Program.
Materials
|
Name |
Company |
Catalog Number |
Comments |
|
Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs |
M0530S |
|
|
Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs |
C2527I |
|
|
Luria Bertani |
VWR |
90003-350 |
|
|
Bacto Agar Media |
VWR |
||
|
kanamycin sulfate |
VWR |
||
|
IPTG |
VWR |
EM-5820 |
|
|
Imidazole |
VWR |
EM-5720 |
|
|
Urea |
VWR |
EM-9510 |
|
|
Dithiothreitol (DTT) |
Fisher |
BP172-5 |
|
|
Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science |
11836153001 |
|
|
DPBS |
VWR |
82020-066 |
|
|
Brilliant Blue R |
Acros Organics |
A0297990 |
|
|
Sodium Azide |
Fisher |
AC190380050 |
Caution, highly toxic |
|
Horseradish peroxidase |
Sigma |
P8125-5KU |
|
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher |
AC408460250 |
Caution, highly toxic |
|
phenol |
Fisher |
AC149340500 |
Caution, highly toxic |
|
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher |
AC180340050 |
Caution, highly toxic |
|
n-heptane |
Acros Organics |
120340010 |
|
| [header] | |||
|
Shaker/Incubator |
Fisher Scientific |
Max Q 6000 |
|
|
Centrifuge |
Sorvall |
RC 6 |
|
|
Sonicator |
QSonica |
Misonix 200 |
|
|
Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra |
UFC903024 |
|
|
Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5248-01 |
|
|
HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences |
17-5156-01 |
|
|
Plate reader |
Molecular Devices |
SpectraMax Gemini EM |
References
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochimie. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C.. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
