पर बैक्टीरिया के प्रभाव को मापने<em> सी. एलिगेंस</emएक अंडा प्रतिधारण परख का उपयोग> व्यवहार
Summary
एक अंडे में कीड़ा (eiw) परख अंडे बिछाने व्यवहार यों के लिए एक उपयोगी तरीका है. अंडा बिछाने में बदलाव मॉडल जीव के एक व्यवहार प्रतिक्रिया हो सकती है<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em> ऐसे रोगजनक बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित उन के रूप में हानिकारक पर्यावरण पदार्थों के लिए.
Abstract
एलिगेंस अंडे बिछाने व्यवहार ऐसी परासारिता 1 और कंपन 2 के रूप में पर्यावरण cues से प्रभावित है. भोजन सी. की कुल अभाव में एलिगेंस भी अंडे बिछाने संघर्ष और उनके गर्भाशय 3 में निषेचित अंडे बरकरार रहती है. हालांकि, विशेष रूप से अलग भोजन के स्रोतों, विशेष रूप से रोगजनक बैक्टीरिया और अंडे बिछाने व्यवहार पर उदर faecalis, के प्रभाव को अच्छी तरह से विशेषता नहीं है. अंडे में कीड़ा (eiw) परख इस मामले ई. में, जीवाणु के विभिन्न प्रकार के प्रभाव यों के लिए एक उपयोगी उपकरण है faecalis, अंडे बिछाने व्यवहार पर.
Eiw assays के सी. के गर्भाशय में बनाए रखा अंडे की संख्या की गणना शामिल एलिगेंस 4. Eiw परख मंचन विरंजन, गर्भवती वयस्क सी. शामिल एलिगेंस छल्ली हटाने और पशु से बनाए रखा अंडे को अलग करने के लिए. पिछले विरंजन के लिए, कीड़े बैक्टीरिया (या पर्यावरण क्यू के किसी भी प्रकार के संपर्क में रहे) समय की एक निश्चित अवधि के लिए. विरंजन के बाद, एक बहुत आसानी से कीड़े के गर्भाशय के अंदर बनाए रखा अंडे की संख्या की गणना करने में सक्षम है. ई. के बाद अंडा प्रतिधारण में इस परख में, एक मात्रात्मक वृद्धि faecalis जोखिम आसानी से मापा जा सकता है. Eiw परख संभावित रोगजनक बैक्टीरिया या पर्यावरण विषाक्त पदार्थों की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक व्यवहार परख है. इसके अलावा, eiw परख अंडे बिछाने व्यवहार इस तरह सेरोटोनिन और acetylcholine 5-9 के रूप में न्यूरोट्रांसमीटर द्वारा संग्राहक है क्योंकि संकेत न्यूरोट्रांसमीटर को प्रभावित करने वाली दवाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए एक उपकरण किया जा सकता है.
Introduction
Caenorhabditis एलिगेंस, एक सूक्ष्म, मुक्त रहने वाले राउंडवॉर्म, पारंपरिक रूप से मनुष्य के लिए है क्योंकि इसकी पारदर्शी शरीर रचना विज्ञान, अच्छी तरह से विशेषता विकास, पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम, लघु पीढ़ी समय, और आनुवंशिक अनुरूपता के विकास और कोशिका संकेतन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक मॉडल जीव है . हाल ही में, सी. एलिगेंस पर्यावरण विष विज्ञान और सहज उन्मुक्ति 10, 11 के क्षेत्र में एक मॉडल जीव बन गया है.
इन स्वयं fertilizing उभयलिंगी कीड़े अंडे से सेने के दो से तीन दिनों के भीतर यौन परिपक्व हो जाते हैं. अपने जीवन चक्र, सी. के दौरान एलिगेंस वयस्कता तक पहुँचने से पहले, चार लार्वा चरणों (एल 1-L4) से होकर गुजरता है. एक पृथक उभयलिंगी शिखर उपजाऊपन के तीन दिनों के भीतर, औसत पर, 300 वंश का उत्पादन कर सकते हैं. प्रजनन परिपक्व सी में एलिगेंस hermaphrodites, निषेचित अंडे रखा जा रहा से पहले कई घंटे के लिए गर्भाशय के अंदर रखा जाता है.किसी एक समय में गर्भाशय में संग्रहीत अंडे की संख्या सामान्य (शिखर उपजाऊपन के दौरान) के बीच दस और पंद्रह 12 है. गर्भाशय में अंडे की संख्या अंडा उत्पादन की दर और अंडे बिछाने की दर दोनों के एक समारोह है. निषेचित अंडे योनी 13 के उद्घाटन के आसपास की व्यवस्था सोलह vulval मांसपेशियों के संकुचन से गर्भाशय से निष्कासित कर दिया है. उभयलिंगी विशेष motorneurons (HSN है) और इस प्रकार कुलपति motorneurons मांसपेशियों के संकुचन को प्रभावित करने vulval मांसपेशियों पर synapse और अंडे बिछाने व्यवहार 5,7,13,14. गर्भाशय से अंडे के निष्कासन न्यूरॉन्स और मांसपेशियों के समन्वित गतिविधि के कारण होता है.
सी. की लैब संस्कृतियों एलिगेंस आमतौर nonpathogenic Escherichia कोलाई OP50 के एक आहार पर उठा रहे हैं. प्राकृतिक वातावरण, सी में एलिगेंस ऐसे रोगजनक बैक्टीरिया के रूप में भोजन के स्रोतों की विविधता के साथ संपर्क में आते हैं, कि हानिकारक हो सकता है. में हानिकारक तत्वों के संपर्क मेंपर्यावरण, सी. पर्यावरण के अधिक अनुकूल हो जाता है जब तक एलिगेंस अंडे बरकरार रहती है. मुमकिन है इस अंडा प्रतिधारण उनकी संतान की रक्षा के लिए एक प्रयास है.
कीड़ा (eiw) परख, सी में इस अंडे में एलिगेंस संभावित रोगजनक बैक्टीरिया, वातावरण में पाया जाता है जो उदर faecalis, के संपर्क में हैं. ई. के रोगजनक रूपों के संपर्क में faecalis सी में लगातार आंत्र संक्रमण और यहां तक कि मौत का कारण बन सकता है एलिगेंस 15. रोगजनक बैक्टीरिया के अन्य रूपों के संपर्क में अंडा प्रतिधारण 16,17 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन प्रभाव मात्रा निर्धारित नहीं किया गया था. ई. के अलावा, हल्का रोगजनक का असर उपभेदों faecalis, अंडे बिछाने व्यवहार पर, तुरंत घातक नहीं हैं कि उपभेदों अध्ययन नहीं किया गया.
Eiw assays के सी. के गर्भाशय में बनाए रखा अंडे की संख्या की गणना शामिल एलिगेंस 4. हालांकि सी. एलिगेंसपारदर्शी हैं, गर्भाशय में जमा अंडे एक अक्षुण्ण जानवर में अंदाजा लगाना मुश्किल हो सकता है. Eiw परख गर्भवती वयस्क सी. विरंजन शामिल समय की एक निश्चित अवधि के लिए बैक्टीरिया के संपर्क में थे कि एलिगेंस. ब्लीच समाधान के पीछे अंडे छोड़ने बाहरी छल्ली घुल. अंडे एक सुरक्षात्मक खोल की उपस्थिति के कारण ब्लीच के प्रभाव को अपवर्तक हैं. विरंजन के बाद, एक बहुत आसानी से विरंजन पर कीड़े के गर्भाशय से जारी अंडे की संख्या की गणना करने में सक्षम है.
वर्णित परख एक समय में गर्भाशय में अंडे की संख्या यों के लिए एक सरल, सस्ता और त्वरित तरीका है, और इस प्रकार ई. के प्रभाव यों अंडे की अवधारण पर faecalis. यह परख अंडा प्रतिधारण पर बैक्टीरिया, पर्यावरण विषाक्त पदार्थों या दवाओं के अन्य प्रकार का प्रभाव मात्रा ठहराना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह परख भी बैक्टीरियल pathogenicity के लिए एक स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
सफलतापूर्वक इस परख प्रदर्शन में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) सी के परिपुष्ट शेयरों का उपयोग कर परख प्लेट, 3 पर एलिगेंस, 2) संवर्धन बैक्टीरिया का एक प्रकार) सही पहचान ई. के लिए जोखिम के लिए L4 के कीड़े …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ई. की आपूर्ति करने के लिए जून मिडलटन शुक्रिया अदा करना चाहूँगा faecalis उपभेदों और मार्गदर्शन के लिए बैक्टीरिया संस्कृति के साथ. सी. एलिगेंस रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर कार्यक्रम के NIH कार्यालय (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित है जो CGC, द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Agar, ultrapure | Affymetrix | 10906 | |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson | 211677 | |
| Bacto Tryptone | Becton Dickinson | 211705 | |
| Brain Heart Infusion dehydrated medium | Carolina Biological Supply | 781781 | |
| C. elegans, N2 strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Culture plates for C. elegans | Tritech Research Inc. | T3308 | |
| Culture plates for E. faecalis | Fisher Scientific-Fisherbrand | 875713 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| E. faecalis strains | provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci | ||
| by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth; | |||
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all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux). |
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| Microscope | Motic | SMZ 168B | any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient |
| Streptomycin sulfate | Fisher BioReagents | BP910-50 | |
| Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco | Becton Dickinson | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL | Becton Dickinson | 211768 | |
| Yeast extract | Acros | 61180-1000 |
References
- Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 216, 1012-1014 (1982).
- Sawin, E. R. . Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1996).
- Trent, C. . Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1982).
- Chase, D. L., Koelle, M. R. Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).
- Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Génétique. 104, 619-647 (1983).
- Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).
- Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
- Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).
- Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. Génétique. 169, 1425-1436 (2005).
- Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).
- Schafer, W. R. . WormBook. , (2005).
- White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).
- Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
- Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- O’Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis. Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).
- Brenner, S. Genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77, 71-94 (1974).
- Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments. BMC Evol. Biol. 8, 15 (2008).
- Harvey, S. C., Orbidans, H. E. All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6, e25840 (2011).
- Klass MR, . Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).
