Измерения воздействия бактерий на<em> C. Элеганс</em> Поведение использованием анализа Яйцо Сохранение
Summary
Яйцо-в-червь (ЕНИ) анализ является полезным методом для количественной яйцекладки поведения. Изменения в откладки яиц может быть поведенческая реакция модельного организма<em> Caenorhabditis Элеганс</em> Потенциально вредных экологических веществ, таких как произведенные патогенных бактерий.
Abstract
C. Элеганс яйцекладка поведение влияют сигналы окружающей среды, такие как осмолярность 1 и вибрации 2. При полном отсутствии питания C. Элеганс также прекратить яйцекладка и сохранять оплодотворенные яйца в матке 3. Тем не менее, влияние различных источников пищи, особенно патогенных бактерий и, в частности Enterococcus фекальный, на яйцекладка поведение не хорошо описана. Яйцо-в-червь (ЕНИ) анализ является полезным инструментом для количественной оценки влияния различных видов бактерий, в данном случае Е. фекальный, на яйцекладка поведения.
ЕНИ анализов включает подсчет количества яиц сохраняется в матке C. Элеганс 4. Анализ ЕНИ включает отбеливание поставил, беременной взрослого C. Элеганс для удаления кутикулы и отделите сохранил яйца от животного. До отбеливания, червей подвергаются воздействию бактерий (или любой другой тип экологических кий) В течение фиксированного периода времени. После отбеливания, одна очень легко рассчитывать количество яиц, сохранил в матку червей. В этом анализе количественного увеличения яйцо удержание после E. фекальный воздействие может быть легко измерено. Анализ EIW поведенческие анализа, которые могут быть использованы для скрининга потенциально патогенных бактерий или наличие токсинов окружающей среды. Кроме того, анализ EIW может быть инструментом для скрининга препаратов, которые влияют на нейротрансмиттер сигнализации с яйцекладки поведение модулируется нейротрансмиттеров, таких как серотонин и ацетилхолин 5-9.
Introduction
Caenorhabditis Элеганс, микроскопический, свободной жизни аскариды, является модельным организмом традиционно используется для изучения и развития клеточных сигнальных процессах из-за его прозрачной анатомии, хорошо характеризуется, С-геномом, последовательность, короткая поколение времени, и генетической гомологии для человека . Совсем недавно С. Элеганс стала модель организма в области экологической токсикологии и врожденный иммунитет 10, 11.
Эти самооплодотворяющимися гермафродиты черви становятся половозрелыми в течение двух-трех дней вылупления из яйца. Во время его жизненного цикла, C. Элеганс проходит через четыре личиночной стадии (L1-L4), до достижения совершеннолетия. Один изолированный гермафродитом может производить, в среднем, 300 потомство в течение трех дней пик плодовитости. В зрелом репродуктивном C. Элеганс гермафродиты, оплодотворенные яйца задерживаются в матке в течение нескольких часов перед укладкой.Нормальное количество яиц, хранившихся в матке в любой момент времени (во время пика плодовитости) составляет от десяти до пятнадцати 12. Число яиц в матке является функцией как скорость производства яиц и скорость откладки яиц. Оплодотворенные яйцеклетки изгоняется из полости матки на сокращения вульвы шестнадцать мышц, расположенных вокруг открытия вульвы 13. Гермафродит конкретных двигательных нейронов (HSN), и VC синапсов мотонейронов на вульвы мышц, влияющих сокращение мышц и, следовательно, яйценоскость поведения 5,7,13,14. Высылка яйца из матки происходит за счет скоординированной деятельности нейронов и мышц.
Лаборатория культур C. Элеганс, как правило, поднял на диете из непатогенных кишечная палочка OP50. В природной среде, C. Элеганс вступают в контакт с различных пищевых источников, таких как патогенные бактерии, которые могут быть потенциально вредными. Под воздействием вредных веществ вокружающей среде, C. Элеганс сохранить яйца, пока окружающая среда не станет более благоприятной. Предположительно это яйцо удержания усилия, чтобы защитить их потомство.
В этом яйцо в червя (ЕНИ) анализа, C. Элеганс подвергаются воздействию потенциально патогенных бактерий, Enterococcus фекальный, который находится в окружающей среде. Воздействие патогенных форм E. фекальный может привести к постоянной кишечной инфекции и даже смерти в C. Элеганс 15. Воздействие других форм патогенных бактерий, как было показано, влияют на яйцо удержание 16,17, однако эффект не был количественно. Кроме того, эффект мягко патогенных штаммов E. фекальный, штаммы, которые не сразу смертельным, на яйцекладка поведении не было изучено.
ЕНИ анализов включает подсчет количества яиц сохраняется в матке C. Элеганс 4. Хотя C. Элеганспрозрачны, яйца накапливается в матке может быть трудно определить количественно в интактного животного. Анализ ЕНИ включает отбеливание беременной взрослого C. Элеганс, которые подвергались воздействию бактерий в течение фиксированного периода времени. Раствор отбеливателя растворяет кутикулу внешней оставляя за яйца. Яйца преломления к воздействию отбеливатель в связи с наличием защитного скорлупы. После отбеливания, одна очень легко рассчитывать количество яиц выпустили из матки червей на отбеливание.
Анализ, описанный простой, недорогой и быстрый метод для количественного определения количества яиц в матке в одно время, и, таким образом количественной оценки последствий E. фекальный на яйцо удержания. Этот анализ может быть использован для количественной оценки влияния других видов бактерий, токсины окружающей среды или препаратов на яйцо удержания. Этот анализ также имеет потенциал для использования в качестве экрана для бактериальной патогенности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важных шагов в успешного проведения этого анализа: 1) с помощью сытых запасов C. Элеганс, 2) культивирование одного типа бактерий на планшет для анализа, 3) точно идентифицировать постановке L4 червей для воздействия E. фекальный, 4) сохранение Выдержка Е. фекальный по…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить июня Миддлтон для подачи E. фекальный штаммов и для руководства с культурой бактерий. C. Элеганс были предоставлены CGC, которая финансируется за счет НИЗ Управления программ исследовательской инфраструктуры (P40 OD010440).
Materials
| Agar, ultrapure | Affymetrix | 10906 | |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson | 211677 | |
| Bacto Tryptone | Becton Dickinson | 211705 | |
| Brain Heart Infusion dehydrated medium | Carolina Biological Supply | 781781 | |
| C. elegans, N2 strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Culture plates for C. elegans | Tritech Research Inc. | T3308 | |
| Culture plates for E. faecalis | Fisher Scientific-Fisherbrand | 875713 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| E. faecalis strains | provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci | ||
| by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth; | |||
|
all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux). |
|||
| Microscope | Motic | SMZ 168B | any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient |
| Streptomycin sulfate | Fisher BioReagents | BP910-50 | |
| Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco | Becton Dickinson | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL | Becton Dickinson | 211768 | |
| Yeast extract | Acros | 61180-1000 |
References
- Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 216, 1012-1014 (1982).
- Sawin, E. R. . Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1996).
- Trent, C. . Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1982).
- Chase, D. L., Koelle, M. R. Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).
- Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Génétique. 104, 619-647 (1983).
- Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).
- Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
- Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).
- Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. Génétique. 169, 1425-1436 (2005).
- Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).
- Schafer, W. R. . WormBook. , (2005).
- White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).
- Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
- Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- O’Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis. Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).
- Brenner, S. Genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77, 71-94 (1974).
- Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments. BMC Evol. Biol. 8, 15 (2008).
- Harvey, S. C., Orbidans, H. E. All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6, e25840 (2011).
- Klass MR, . Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).
