Het meten van de effecten van bacteriën op<em> C. Elegans</em> Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

Summary

Een ei-in-worm (EIW) test is een handige methode om eierleggende gedrag te kwantificeren. Veranderingen in eileg kan een gedragsmatige reactie van het modelorganisme zijn<em> Caenorhabditis elegans</em> Aan potentieel schadelijke stoffen uit het milieu, zoals die geproduceerd door pathogene bacteriën.

Abstract

C. elegans eileg gedrag wordt beïnvloed door omgevingsfactoren zoals osmolariteit ¹ en trillingen ^2. Bij totale afwezigheid van voedsel C. elegans ook ophouden eileg en behouden van bevruchte eieren in hun baarmoeder ^3. Echter, het effect van verschillende voedingsbronnen name pathogene bacteriën en bijzonder Enterococcus faecalis, on leg gedrag niet goed gekarakteriseerd. De ei-in-worm (EIW) test is een nuttig hulpmiddel om de effecten van verschillende soorten bacteriën kwantificeren, in casu E. faecalis, on leg gedrag.

EIW assays omvatten het tellen van het aantal eieren in de baarmoeder van C. behouden elegans ^4. De EIW bepaling omvat bleken opgevoerd, zwangere volwassen C. elegans om de cuticula te verwijderen en scheiden de ingehouden eieren van het dier. Voorafgaand aan bleken, zijn wormen worden blootgesteld aan bacteriën (of een soort van milieu-cue) Voor een vaste periode van tijd. Na bleken, is erg gemakkelijk in staat om het aantal in de baarmoeder van de wormen behouden tellen van eieren. In deze assay, een kwantificeerbare toename ei retentie na E. faecalis belichting kan gemakkelijk worden gemeten. De EIW assay is een gedrags-test die kan worden gebruikt om te screenen op potentieel pathogene bacteriën en de aanwezigheid van giftige stoffen. Daarnaast kan de EIW assay een middel voor het screenen op geneesmiddelen die neurotransmitter beïnvloeden signalering sinds leg gedrag wordt gemoduleerd door neurotransmitters als serotonine en acetylcholine ^5-9 zijn.

Introduction

Caenorhabditis elegans, een microscopische, vrij levende rondworm, een modelorganisme traditioneel gebruikt ontwikkelings-en cel signalerende processen, omdat de transparante anatomie, goed gekarakteriseerde ontwikkeling volledig gesequenced genoom korte generatietijd-tijd en genetische homologie onderzoek bij de mens . Recenter C. elegans is een modelorganisme op het gebied van milieu-toxicologie en aangeboren immuniteit ^{10, 11.}

Deze zelfbemestende hermafrodiete wormen worden geslachtsrijp binnen twee tot drie dagen van het uitbroeden van het ei. Tijdens zijn levenscyclus, C. elegans doorloopt vier larvale stadia (L1-L4), vóór het bereiken van de volwassenheid. Een geïsoleerde hermafrodiet kan produceren, gemiddeld, 300 nakomelingen binnen drie dagen van de piek vruchtbaarheid. In reproductively mature C. elegans hermafrodieten, worden bevruchte eitjes in de baarmoeder behouden voor enkele uren voordat ze gelegd. Denormale aantal eieren opgeslagen in de baarmoeder op een bepaald moment (tijdens de piek vruchtbaarheid) is tussen de tien en vijftien ^12. Het aantal eieren in de baarmoeder is een functie van zowel de snelheid van de eierproductie en de snelheid van de eileg. Bevruchte eitjes worden uitgestoten uit de baarmoeder van de samentrekking van zestien vulval spieren rond de opening van de vulva ^13. Hermafrodiet-specifieke motorneurons (HSN) en VC motorneurons synaps op vulval spieren die samentrekken van de spieren en dus eierleggende gedrag ^5,7,13,14. Uitwijzing van eieren in de baarmoeder optreedt als gevolg van gecoördineerde aktiviteit van neuronen en spieren.

Lab culturen van C. elegans zijn meestal opgegroeid op een dieet van pathogene Escherichia coli OP50. In de natuurlijke omgeving, C. elegans in contact komen met een verscheidenheid van voedselbronnen, zoals pathogene bacteriën, die potentieel schadelijke. Bij blootstelling aan schadelijke stoffen inmilieu, C. elegans behouden eieren totdat het klimaat gunstiger wordt. Vermoedelijk dit ei retentie is een poging om hun nageslacht te beschermen.

In dit ei in worm (EIW) assay, C. elegans worden blootgesteld aan de potentieel pathogene bacteriën, Enterococcus faecalis, die in het milieu. Blootstelling aan pathogene vormen van E. faecalis kan blijvende darminfectie en zelfs de dood veroorzaken in C. elegans ^15. Blootstelling aan andere vormen van pathogene bacteriën is aangetoond ei retentie ^16,17 beïnvloeden, maar het effect is niet gekwantificeerd. Bovendien, het effect van licht pathogene stammen van E. faecalis, heeft stammen die niet direct dodelijk, op eileg gedrag niet onderzocht.

EIW assays omvatten het tellen van het aantal eieren in de baarmoeder van C. behouden elegans ^4. Hoewel C. eleganstransparant zijn, kunnen eieren ophopen in de baarmoeder moeilijk te kwantificeren in een intact dier. De EIW bepaling omvat bleken zwangere volwassen C. elegans die werden blootgesteld aan bacteriën voor een vaste periode van tijd. De bleekoplossing lost de buitenste cuticula verlaten de eieren achteren. De eieren zijn refractieve om de effecten van bleekmiddel door de aanwezigheid van een beschermende eierschaal. Na bleken, is erg gemakkelijk in staat om het aantal eieren vrijgemaakt uit de baarmoeder van de wormen na bleken tellen.

De beschreven test is een eenvoudige, goedkope en snelle methode om het aantal eieren in de baarmoeder te kwantificeren in een keer, en daarmee de effecten van E. kwantificeren faecalis op ei-retentie. Deze test kan worden gebruikt om het effect van andere soorten bacteriën, giftige stoffen of geneesmiddelen op ei retentie kwantificeren. Deze test heeft ook het potentieel om te worden gebruikt als scherm voor bacteriële pathogeniciteit.

Protocol

1) Voorbereiding van Nematoden Groei Media (NGM) Tot 50 platen te maken, voeg 1,5 g NaCl, 8,5 g Ultrapure Agar, en 1,25 g pepton een 1 Lflask. Voeg 487,5 ml dH 2 O aan kolf. Roer voorzichtig te mengen en te dekken opening van kolf met een stuk aluminiumfolie. Steriliseren van de oplossing in de autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 min). Laat de oplossing in een waterbad te koelen tot 45 ° C. Aan de oplossing, voeg de volgende in volgorde:…

Representative Results

Deze test maakt het mogelijk om het aantal behouden eieren kwantificeren binnen C. elegans na blootstelling aan E. faecalis. L4 opgevoerd wormen (gekenmerkt door transparante open ruimte boven de vulva, figuur 1) werden blootgesteld aan E. faecalis door volwassenheid. Na veertig uur van blootstelling aan E. faecalis, bleken uitgevoerd. Aangezien de cuticula gedesintegreerd in het bleekmiddel druppeltje, de eieren duidelijker werd (Figuur 2). Het aanta…

Discussion

De meest kritische stappen in het succesvol uitvoeren van deze test zijn: 1) met goed gevoede voorraden C. elegans, 2) het kweken van enkele soorten bacteriën op de testplaat, 3) de nauwkeurige identificatie van geënsceneerde L4 wormen voor blootstelling aan E. faecalis, 4) het houden van de blootstelling tijd om E. faecalis consistent in alle proeven en 5) bleken de tijd mag niet meer dan tien minuten voor ei desintegratie te voorkomen.

Voor deze test is het bel…

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
			by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
			all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000