Medición de los efectos de las bacterias en<em> C. Elegans</em> Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

Summary

Un ensayo de huevo-en-gusano (EIW) es un método útil para cuantificar el comportamiento de puesta de huevos. Las alteraciones de la postura de huevos pueden ser una respuesta de comportamiento del organismo modelo<em> Caenorhabditis elegans</em> A sustancias ambientales potencialmente nocivas, tales como las producidas por bacterias patógenas.

Abstract

C. elegans comportamiento de puesta de huevos se ve afectada por señales ambientales tales como la osmolaridad ¹ y la vibración ^2. Ante la falta total de alimentos C. elegans también dejan la puesta de huevos y retienen los huevos fertilizados en el útero ^3. Sin embargo, el efecto de diferentes fuentes de alimentos, especialmente bacterias patógenas y en particular de Enterococcus faecalis, en el comportamiento de puesta de huevos no está bien caracterizado. El ensayo de huevo-en-gusano (EIW) es una herramienta útil para cuantificar los efectos de diferentes tipos de bacterias, en este caso E. faecalis, en el comportamiento de puesta de huevos.

EIW ensayos implican contando el número de huevos retenidos en el útero de C. elegans ^4. El ensayo consiste en EIW blanqueo etapas, grávido adultos C. elegans para quitar la cutícula y se separan los huevos retenidos desde el animal. Antes de blanqueo, los gusanos están expuestos a las bacterias (o cualquier tipo de señal ambiental) Durante un período de tiempo fijo. Después del blanqueo, uno es muy fácilmente capaz de contar el número de huevos retenidos en el interior del útero de los gusanos. En este ensayo, un aumento cuantificable en la retención de huevo después de E. la exposición faecalis se puede medir fácilmente. El ensayo EIW es un ensayo de comportamiento que puede ser utilizado para la detección de bacterias potencialmente patógenas o la presencia de toxinas del medio ambiente. Además, el ensayo de EIW puede ser una herramienta para la detección de drogas que afectan neurotransmisor de señalización ya que el comportamiento puesta de huevos es modulada por los neurotransmisores como la serotonina y la acetilcolina ^5-9.

Introduction

Caenorhabditis elegans, un gusano redondo microscópica, de vida libre, es un organismo modelo utilizado tradicionalmente para estudiar los procesos de desarrollo y la señalización celular, debido a su anatomía transparente, el desarrollo bien caracterizado, totalmente secuenciado del genoma, en tiempo de generación corto, y la homología genética de los seres humanos . Más recientemente, C. elegans se ha convertido en un organismo modelo en el campo de la toxicología del medio ambiente y la inmunidad innata ^{10, 11.}

Estos gusanos hermafroditas auto-fertilizantes alcanzan la madurez sexual a los dos o tres días de la eclosión del huevo. Durante su ciclo de vida, C. elegans pasa por cuatro estadios larvales (L1-L4), antes de llegar a la edad adulta. Un aislado hermafrodita puede producir, en promedio, 300 crías dentro de los tres días de la fecundidad alta. En la madurez reproductiva C. elegans hermafroditas, los huevos fertilizados son retenidos dentro del útero durante varias horas antes de ser establecido. Lanúmero normal de los huevos almacenados en el útero a la vez (durante el pico fecundidad) es de entre diez y quince ^12. El número de huevos en el útero es una función tanto de la tasa de producción de huevos y la tasa de puesta de huevos. Los huevos fertilizados son expulsados ​​del útero por la contracción de los músculos vulvares dieciséis dispuestas alrededor de la abertura de la vulva ^13. Motoneuronas Hermafrodita específicos (HSN 's) y neuronas motoras VC sinapsis en los músculos vulvares que afectan a la contracción muscular y por lo tanto la puesta de huevos comportamiento ^5,7,13,14. La expulsión de los huevos desde el útero se produce debido a la actividad coordinada de las neuronas y los músculos.

Cultivos de laboratorio de C. elegans se plantean típicamente en una dieta de no patógenas de Escherichia coli OP50. En el medio natural, C. elegans entran en contacto con una variedad de fuentes de alimentos, tales como bacterias patógenas, que pueden ser potencialmente dañinos. Cuando se expone a sustancias nocivas enel medio ambiente, C. elegans retienen los huevos hasta que se convierte en el medio ambiente más favorable. Es de suponer que esta retención de huevo es un esfuerzo para proteger a sus crías.

En este huevo en el ensayo, C. gusano (EIW) elegans están expuestos a las bacterias potencialmente patógenas, Enterococcus faecalis, que se encuentra en el medio ambiente. La exposición a formas patógenas de E. faecalis puede causar una infección intestinal persistente e incluso la muerte en C. elegans ^15. La exposición a otras formas de bacterias patógenas han sido demostrado que afectan a la retención de huevo ^16,17, sin embargo, el efecto no se cuantificó. Además, el efecto de las cepas patógenas de E. ligeramente faecalis, cepas que no son inmediatamente letal, en el comportamiento de puesta de huevos no se ha estudiado.

EIW ensayos implican contando el número de huevos retenidos en el útero de C. elegans ^4. A pesar de que C. elegansson transparentes, los huevos se acumulan en el útero pueden ser difíciles de cuantificar en un animal intacto. El ensayo consiste en EIW blanqueo grávido adultos C. elegans que fueron expuestos a las bacterias por un período fijo de tiempo. La solución de cloro se disuelve la cutícula exterior dejando detrás de los huevos. Los huevos son de refracción a los efectos de cloro debido a la presencia de una cáscara de huevo. Después del blanqueo, uno es muy fácilmente capaz de contar el número de óvulos liberados desde el útero de los gusanos a blanqueo.

El ensayo descrito es un método simple, barato y rápido para cuantificar el número de huevos en el útero de una sola vez, y por lo tanto cuantificar los efectos de E. faecalis sobre la retención de huevos. Este ensayo se puede utilizar para cuantificar el efecto de otros tipos de bacterias, toxinas ambientales o fármacos sobre la retención de huevo. Este ensayo también tiene el potencial para ser utilizado como una pantalla para la patogenicidad bacteriana.

Protocol

1) Preparación de nematodos Medio de Crecimiento (NGM) Para hacer 50 platos, añadir 1,5 g de NaCl, 8,5 g Agar ultrapura, y 1,25 g de peptona al 1 Lflask. Añadir 487,5 ml de H 2 O al matraz. Agitar suavemente para mezclar y cubrir la apertura del frasco con un trozo de papel de aluminio. Esterilizar la solución en autoclave a condiciones estándar (121 psi, 120 ° C, 20 min). Dejar que la solución se enfríe a 45 ° C en un baño de agua. A la solución, …

Representative Results

Este ensayo permite cuantificar el número de huevos retenidos en C. elegans después de la exposición a E. faecalis. L4 escena gusanos (caracterizado por el espacio abierto transparente por encima de su vulva, Figura 1) fueron expuestos a E. faecalis a través de la edad adulta. Después de cuarenta horas de exposición a E. faecalis, se llevó a cabo el blanqueo. A medida que la cutícula se desintegró en la gota de lejía, los huevos se hicieron más evidentes <s…

Discussion

Los pasos más importantes en la realización con éxito este ensayo son: 1) el uso de acciones bien alimentados de C. elegans, 2) cultivar tipos individuales de bacterias en la placa de ensayo, 3) identificar con precisión por etapas L4 gusanos para la exposición a E. faecalis, 4) mantener el tiempo de exposición a E. faecalis consistentes en todos los juicios y 5) el tiempo de blanqueo no debe exceder de diez minutos para evitar la desintegración de huevo.

Pa…

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
			by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
			all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000