Transient Proteinproduktion in Pflanzen Nicotiana basierend auf Vakuum-Infiltration mit Agrobakterien Buchstart-Vektoren (Tabak-Mosaik-Virus-basierten) ist ein schneller und wirtschaftlicher Ansatz für Impfstoff-Antigene und therapeutische Proteine zu produzieren. Wir vereinfacht das Verfahren und die verbesserte Ziel Akkumulation durch die Optimierung der Bedingungen von Bakterien Anbau, Auswahl Wirtsarten, und Co-Einführung von RNA-Silencing Unterdrücker.
Agrobacterium-vermittelte transiente Proteinproduktion in Pflanzen ist ein vielversprechender Ansatz zur Impfstoffantigene und therapeutische Proteine in kurzer Zeit zu produzieren. Allerdings ist diese Technologie erst am Anfang, um die Großproduktion, wie viele technologische Hindernisse, Scale-up aufgetragen werden nun überwunden werden. Hier zeigen wir eine einfache und reproduzierbare Methode für die industrielle transiente Protein-Produktion auf Basis von Vakuum-Infiltration von Nicotiana Pflanzen mit Agrobakterien Bucheinführung Vektoren. Optimierung von Agrobacterium Anbau in AB-Medium ermöglicht die direkte Verdünnung der Bakterienkultur in Milli-Q-Wasser, die Vereinfachung der Infiltrationsprozess. Unter drei getesteten Arten von Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) wurde als der vielversprechendste Host aufgrund der Einfachheit der Infiltration ausgewählt, die hohe Reporterprotein Produktion, und etwa zwei-falt höhere Biomasseproduktion unter kontrollierten Umweltbedingungen. Induktion von Agrobacterium pBID4-GFP (Tabak-Mosaik-Virus-Basis) unter Verwendung von Chemikalien wie Acetosyringons Monosaccharid und hatte keine Auswirkungen auf die Produktionsebene Protein. Eindringen Pflanze unter 50 bis 100 mbar für 30 oder 60 Sekunden zu einer etwa 95% Infiltration von Pflanzenblattgewebe. Infiltration mit Agrobacterium Laborstamm GV3101 zeigten im Vergleich zu Agrobakterien LBA4404 Laborstämme und C58C1 und Wildtyp-Agrobakterien-Stämme AT6, AT10, AT77 und A4 die höchste Proteinproduktion. Co-Expression einer viralen RNA-Silencing-Suppressor, p23 oder p19, in N. benthamiana führte in früheren Akkumulation und erhöhte Produktion (15-25%) des Zielproteins (Influenza Virus Hämagglutinin).
Die Pflanzen werden nun als eine sichere, zuverlässige, skalierbare und kostengünstige Plattform für die Herstellung von heterologen rekombinanten Biopharmazeutika und industrielle Proteine 3.1 erkannt und haben wichtige Vorteile gegenüber mikrobiellen und tierischen Zellexpressionssysteme 4. Pflanzen sind in der Lage, korrekt gefalteten Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen, einschließlich montiert multimeren Antikörper 5-7 auszudrücken. Mehrere Pflanzen gewonnene rekombinante pharmazeutische Proteine werden in der klinischen Evaluation 8. Dazu gehören Patienten-spezifischen rekombinanten Impfstoffe Idiotyp (scFv) für die Behandlung des Non-Hodgkin-Lymphom 9, Hämagglutinin-Basis-Pandemie und die saisonale Grippe-Impfstoff-Kandidaten 10,11 (Cummings et al., Um Impfstoff eingereicht), Anti-Streptococcus-Oberflächenantigen I / II-Antikörpers zur Behandlung von Zahnkaries 12 und Human-Insulin zur Behandlung von Diabetes 13. Außerdem menschlichen recombinant Glukozerebrosidase für die Enzymersatztherapie bei Patienten mit Gaucher-Krankheit hat in Israel und in den USA zugelassen und wird unter dem Expanded-Access-Programm außerhalb der USA 14,15 vorgesehen.
Heterologe Proteine können in stabil transformierten (transgene oder transplastomischer) oder transient transformierte Pflanzen produziert werden. Transient Proteinherstellung bietet mehrere Vorteile gegenüber der Produktion in transgenen Pflanzen, einschließlich kurzer Zeit, um die Expression und Akkumulation 16 zu erreichen, und kann durch die Einführung von bakteriellen binären Vektoren oder rekombinanten Pflanzenvirusvektoren in Pflanzengewebe 4 erreicht werden. Das am weitesten fortgeschrittene transienten Expressionssystem beruht auf der Verwendung von "Start-Vektoren", die Komponenten von Pflanzenviren und binären Plasmide kombinieren und durch Agroinfiltration 17,18 geliefert basiert. Agroinfiltration von einem Startvektor auf Basis von Tabakmosaikvirus (TMV) wurde erfolgreich am Labor angewendetskalieren, um Impfstoffantigene gegen Krankheitserreger wie Human Papilloma Virus 19, Yersinia pestis 20 produzieren, Viren Influenza A 21,22, Bacillus anthracis 23 und Pocken-Virus 24 de N. benthamiana Blättern. Agrobacterium-vermittelte transiente Expression ist auch ein vielversprechendes Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von mehreren Proteinen 2,25-27. Zum Beispiel haben Pflanzen vorübergehende Expressionssysteme verwendet worden, um Tumor-spezifische rekombinante Antikörper 28,29, ein glycosyliertes rekombinantes Antikörpers gegen den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 30 und einen monoklonalen Antikörper, der für Anthrax-Schutzantigen 31,32 erzeugen. Co-Infiltration von Nicotiana benthamiana Pflanzen mit einer Ziel-Gen und Suppressor der Gen-Silencing führt zu einer erhöhten Expression des Zielproteins 33,34.
Agroinfiltration ist eine gängige Methode zur gleichmäßigen introduCING Bakterien beherbergen, ein Gen von Interesse in pflanzlichen Geweben 35-37. Vakuum-Infiltration von Agrobacterium für transiente Genexpression in intakten Pflanzenblättern ist eine schnelle, skalierbare und nützliche Methode für die Produktion von Fremdproteinen, ohne dass transgene Pflanzen 38-41 generieren. Während Vakuum Agroinfiltration werden die Pflanzen auf den Kopf gestellt und oberirdischen Teile in Agrobacterium-Suspension getaucht. Dann Vakuum angelegt, wodurch Gase aus Blattinterzellulären Räumen durch Spaltöffnungen zu evakuieren. Schnelle Wieder Druckbeaufschlagung nach Freigabe des Vakuums führt die Infusion von Agrobacterium-Suspension in das Blatt. Nach Vakuuminfiltration von Agrobakterien werden die Pflanzen weiter kultiviert und Zielausdruck wird überwacht. Die höchsten Zielausdruck werden in der Regel 2-3 Tage nach beobachtet Infiltration (dpi) mit einer binären Vektor und 4-7 dpi bei einer Einführung Vektor, nach der das Expressionsniveau in der Regel abnehses 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens ist der am häufigsten verwendete Träger für die Abgabe eines Gens von Interesse in eine Anlage zur Herstellung von Proteinen. Agroinfiltration funktioniert außerordentlich gut in N. benthamiana aber relativ schlecht in den meisten anderen Pflanzen, darunter 46 Arabidopsis thaliana.
In dieser Studie wurde ein einfaches, effizientes und wirtschaftliches Verfahren für die transiente Proteinproduktion in 5-6 Wochen alten N. entwickelten wir benthamiana mit A. tumefaciens Infiltration. Der Hauptnachteil von Industrie Skalierung der Agroinfiltration Technik ist die Zentrifugation der geernteten Bakterien und Resuspension des Bakterienpellets in einem Medium, 4'-Hydroxy-3 ', 5'-Dimethoxyacetophenon (Acetosyringon) Monosaccharide, und 2 – (N-Morpholino) -ethansulfonsäure (MES)-Puffer für die Induktion der vir-Gene. Wir waren in der Lage, diese Probleme durch die Optimierung der Agrobacterium überwinden </em> Wachstum in AB-Medium (Minimalmedium), gefolgt von Verdünnung direkt in Milli-Q-Wasser und durch Steuern der Infiltrationszeit und Bedingungen. Wir haben auch Zielprotein-Produktion im Vergleich zu dem Wildtyp-Tabakwirtsarten N. benthamiana und N. Holzwolle, als auch in Hybrid N. excelsiana.
In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll für Agroinfiltration Routine transiente Proteinproduktion in ausgewählten Nicotiana-Arten mit Hilfe von Agrobacterium-Stämme, die die Markteinführung Vektor entwickelt. Darüber hinaus haben wir die optimalen Bedingungen ermittelt, die höchste Produktion rekombinanter Proteine Ebene in unserem vorübergehenden Pflanzenexpressionssystem zu erreichen.
Vakuum-Infiltration der verdünnten A. tumefaciens Stamm GV3101 beherbergen die Startvektor pBID4 in N. benthamiana, N. excelsiana und N. excelsior in höheren Ebenen der Zielproteinproduktion innerhalb 7 dpi im Vergleich zu anderen Pflanzenarten, wie Pisum sativum mit GV3101 beherbergen, Alfalfa-Mosaik-Virus infiltriert – oder Cucumber-Mosaik-Virus-basierte Vektoren, die das GFP-Reporter-Gen unter der 35S-Promotors 41, oder Lactuca sativa, Solanum lycopersicum und Arabidopsis thaliana mit dem C58C1 Stamm von A. infiltriert tumefaciens mit dem beta-Glucuronidase-Reportergens 57. N. benthamiana und N. excelsiana waren einfach zu infiltrieren Vakuum bei 50 mbar für 30-60 sec, mit 90-95% Infiltration Effizienz. Die verbleibenden 5-10% der Blattfläche nicht wegen irgend Floating der Blätter auf der Oberfläche des Agrobacterium-Suspension während des Aufbringens des Vakuums infiltriert. Seit der Einführung Vektor hat die Fähigkeit für Zell-zu-Zell-Bewegung 18, tritt transiente Proteinakkumulation in ganze Blätter sowie Blattstiele bei 7 dpi. Bei 10 dpi, war die geschätzte GFP Produktion etwas niedriger, weil die pBID4 Expressionsvektor ist in der Lage, von Zelle zu Zelle bewegen, aber nicht systemisch 18 zu bewegen; daher neu gewachsene Blätter enthalten den Vektor nicht und nicht um die Produktion von Ziel beitragen. Zusätzlich Abbau des rekombinanten Proteins mit der Zeit may reduziert Proteinebene beitragen bei 10 dpi. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Infiltration des A. tumefaciens Stamm GV3101 vermittelte hohe transiente Proteinproduktion in N. benthamiana. Ferner können Zielprotein als N-terminale, C-terminale oder interne Fusionen Lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-Glucanase, welche ein thermostabiles Enzym aus Clostridium thermocellum ist und Thermostabilität verleiht vielen Ziel konstruiert werden, Protein-Fusion 18. Die Infiltration von N. benthamiana mit A. tumefaciens-Wildtyp-Stämme (AT6, AT10 und AT77) beherbergt das Gen von Interesse hervorgerufen milde oder schwere Symptome: Blatteisstockschießen, Blattstiel Dehnung und Eisstockschießen. Keine pathologischen Symptome wurden in N. beobachtet benthamiana infiltriert mit dem Laborstamm GV3101 beherbergen leer pBID4 Vektor, während einige Gene in pBID4 eingeführt und in Labor-Stämme GV3101, C58C1 oder LBA4404 ausgelöst milden nekrotischen Antworten und BlattChlorose / Vergilbung Symptome bei infiltriert Regionen der Blätter. Necrotic Symptome, die durch Wildtyp-Stämmen Agrobacterium oder unscharf in Nachtschattengewächse verursacht haben bisher 56,57 berichtet. Die nekrotische Reaktion konnte von Virulenzfaktoren des Sekretionssystem vom Typ III, bakteriellen Proteinen in die Pflanzenzelle durch die Typ IV-Sekretionssystem übertragen und / oder Empfindlichkeit für Flagellin 58-60 führen. Wir haben festgestellt, dass transiente Produktion von heterologen Proteine können auch entlocken Pathogenität und eine hypersensible Reaktion in infiltriert Anlage verlässt. Viele Forscher berichtet, dass die Agroinfiltration von verschiedenen Pflanzenarten mit Pflanzen binären Vektoren bis zu 5-20 mal höhere transiente Proteinproduktion im Vergleich zu stabil transformierten Pflanzen 28,57 hergestellt. Unsere Daten zeigen, dass N. benthamiana infiltriert mit GV3101 beherbergen pBID4-GFP transient exprimierten hohe Niveaus von GFP, die ähnlich der GFP Ausbeute für gemeldeteN. benthamiana mit Agrobakterien Durchführung der Pich-GFPSYS viralen Vektor (bis zu 80% des gesamten löslichen Proteins) 44 infiltriert. Agroinfiltration mit unserem Start-Vektor führte zu hohen Produktion von thermostabilen Protein LicKM, 50-fach höher als die Verwendung eines binären Standard-Plasmid-18 beobachtet.
Um die Infektiosität von A. Test tumefaciens und die Stabilität der Markteinführung Vektor, ein Flach von N. infiltriert wir benthamiana jede Stunde für bis zu 8 Stunden mit dem gleichen Milli-Q-Wasser verdünnten Kultur der GV3101 beherbergen die pBID4-GFP-Plasmid. Unsere Daten zeigten, dass der Stamm GV3101 effizient für mindestens 8 h und pBID4 (die Einführung Vektor) infektiös ist während der 8 Stunden lang Infiltration sehr stabil.
Glycerin Lager von GV3101 Stamm, der den Start-Vektor pBID4 HAC1 (Zellbank) bei -80 ° C gelagert wurde gezeigt, dass für drei Jahre als sehr stabil, ohne die Änderungen in transienten protein der Produktion in Pflanzen infiltriert.
N. benthamiana Pflanzen unter optimalen Bedingungen und zwischen 35 und 42 Tage nach der Aussaat gewachsen waren optimal für Vakuuminfiltrations-vermittelte transiente Genexpression 40. Jungpflanzen (3-4 Wochen alt) nicht vollständig, weil der schwimmenden Blätter auf der Zellsuspensionsoberfläche und Gewebeschäden von der mechanischen Wirkung des Anlegens eines Vakuums infiltriert werden. In Anlagen, die älter als 45 Tage, N. benthamiana Verschrauben der Bühne, unter den verwendeten optimalen Lichtverhältnissen, ist das Niveau der transiente Expression gering.
Niedermolekulare phenolische Verbindungen (Acetosyringon) und monosaccharaides (Glukose) sind dafür bekannt, vir-Gene de A. tumefaciens 55,61 induzieren. Außerdem Infiltration von N. benthamiana mit dem binären Vektor pCAMBIA (GFP) in Anwesenheit von Acetosyringon bei Konzentrationen von 50-600 &mgr; M gezeigt, geringfügig vorübergehende ZunahmeGenexpression 40. Wir untersuchten die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von Acetosyringon und Glucose in unserem System durch Zugabe dieser Verbindungen zu GV3101 Kulturen beherbergen pBID4-GFP in MMA für 3 h, und fand keinen Unterschied in der GFP-Expression. Interessanterweise GV3101 Kulturen beherbergen pBID4-GFP und in Milli-Q-Wasser auf eine A 600 von 0,5 verdünnt und infiltriert ohne die vir-Gen Induktion exprimiert die gleichen Mengen an GFP als diejenigen mit induzierten Kulturen infiltriert. Die A. tumefaciens vir-Gen (n) könnte möglicherweise durch Pflanzen phenolische Verbindungen (Acetosyringon und Sinapinsäure) und Pflanzen monosaccharaides (Glucose und Fructose) in Blattgewebe vorhanden induziert werden. Daher spekulieren wir, dass ähnliche Niveaus der GFP-Expression in Gegenwart oder Abwesenheit von exogenen Induktoren vir-Gen kann ein Ergebnis der Wirkung der zytoplasmatischen vir-Gen Induktoren während der Replikation der GFP-exprimierenden Vektor Einführung in Pflanzenzellen vorliegen.
<p class= "Jove_content"> Wildtyp N. benthamiana als Modell-Host für transiente Proteinproduktion 49 verwendet worden. Jedoch relativ niedrigen Biomasseertrag N. benthamiana 's behindert seine Anwendung für die Großproduktion von rekombinanten Proteinen. Die optimale Host sollte eine hohe transiente Expression, einfach Wachstum im Gewächshaus zu kombinieren und anfällig sein Agrobacterium Infiltration 2. Um eine alternative Host auswählen, infiltriert wir zwei verschiedene Arten Wildtyp von Nicotiana (N. benthamiana und N. excelsior) und ein Hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) mit der A. GV3101 beherbergen die pBID4-GFP-Plasmid. Unter diesen drei Arten, die Höhe der GFP-Expression in N. geringfügig höheren benthamiana. N. excelsior Pflanzen zeigten Schwierigkeiten im Vakuum Agroinfiltration aufgrund ihrer ledrigen Blättern, und N. excelsianaproduziert etwa zwei-mal Biomasse unter den gleichen Wachstumsbedingungen. Die transiente Produktion von GFP bei 7 dpi in N. relativ ähnlich ist benthamiana und N. excelsiana. Daher N. excelsiana kann ein geeigneter Wirt für die Produktion rekombinanter Proteine sein.Agrobacterium-vermittelte transiente Proteinproduktion durch PTGS 26, die durch Co-Expression von Gen-Silencing-Suppressoren des Pflanzenvirus Ursprungs 62 überwunden werden kann, begrenzt. Transiente Proteinproduktion wurde zuvor gezeigt, um das 50-fache in Gegenwart der p19-Protein von TBSV, die PTGS in infiltrierten Geweben hemmt 34 verbessert werden. In unserer Studie untersuchten wir die Wirkung von zwei viralen Silencing Unterdrücker (p19 und p23) mit der Einführung pBID4 Vektor-HAC1 separat Zusammenarbeit infiltriert. Der Co-Infiltration dieser Silencing-Suppressoren schien wenig Einfluss auf transiente Expression HAC1 haben, mit nur einer leichten Erhöhung der HAC1Protein-Akkumulation (15-25%) in Gegenwart von Co-infiltrierten p23 oder p19. Um positiv auf die Proteinproduktion, muss zum Schweigen Drücker gezielt ausgewählt, um effektiv für die gezielten Pflanzenarten und viralen Vektor 63 sein werden. TMV Helikase hat einen Suppressor der RNA-Silencing-Aktivität 64,65. Unsere Daten bestätigen diese Beobachtung als Co-Infiltration von p23 oder p19 mit pBID4-HAC1 führte zu keiner Erhöhung der GFP oder einem leichten Anstieg in der Übergangs HAC1 Proteinproduktion.
Zusammenfassend haben wir geändert und optimiert Anlagen und Agrobacterium Wachstumsbedingungen und verbessert die Effizienz der Vakuum-Infiltration. Diese Technologie ermöglicht es uns, in ein paar Stunden zu wachsen und zu infiltrieren Hunderte von Kilogramm Pflanzenmaterial. Wir die Anlage transiente Expression Technik für die Hochdurchsatz-Impfstoff-Produktion im industriellen Maßstab unter current Good Manufacturing Practices (cGMP) Bedingungen erfolgreich automatisiert. Für weitere Informationen about Automatisierung und Auslastung der Anlage transiente Protein-Produktionsanlage für die Produktion von rekombinanten Proteinen, einschließlich Subunit-Impfstoff-Kandidaten, unter cGMP-Bedingungen werden die Leser auf die Website verwiesen www.fhcmb.org/ .
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, iBio, Inc. und der Defense Advanced Research Projects Agency (Zuschuss # HDTRA1-07-C-0054) unterstützt. Die Autoren erkennen die großzügige Geschenke von Drs.. Stanton Gelvin von Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens-Stämme) und Wayne Fitzmaurice von Large Scale Biology Corporation (N. excelsiana Samen) sowie Jennifer Nicholson US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior Samen ). Die Autoren danken Margaret Shillingford und Christopher Hull zur Versorgung von Pflanzen und ausgezeichnete technische Hilfe. Die Autoren bedanken sich auch DRS. Stephen Streatfield und Natasha Kushnir für die redaktionelle Unterstützung.
Nicotiana benthamiana | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555478 TW16 | Infiltration |
Nicotiana excelsior | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555685 TW47 | Infiltration |
Nicotiana excelsiana | Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA | LSBC EBA 042304.02 | Infiltration |
Vacuum skid | Abbas, Ashland, MA | Custom made | Plant infiltration |
Rockwool | Grodan Inc., Ontario, Canada | AO 50/40 | Hydroponic media for growing plant |
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid | Acros Organics, Thermo Fisher Scientific NJ |
172595000 | Buffer |
Murashige & Skoog salt (MS salt) | Phyto Technology Lab | M524 | Tissue culture media |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406-5G | Agrobacterium induction |
Immobilon-P transfer membrane | Millipore, Billerica, MA | IPVH00010 | Western blotting |
I-block | Applied Biosystems, Foster City, CA | T2015 | Western blotting |
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum | Washington Biotechnology, Baltimore, MD | Western blotting | |
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody | Qiagen GmbH, Hilden | 34670 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 111-035-003 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115-035-003 | Western blotting |
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate | Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL | 34078 | Western blotting |
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | P-LICHN | Lichenase Activity |
Congo Red | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6277 | Gel staining |
Digital camera | Olympus, Center Valley, PA | C-8080 | Chemiluminescence imaging |
GeneGnome | Syngene, Frederick, MD | Chemiluminescence imaging | |
GFP standard | Made in house | Chemiluminescence imaging | |
Plant fertilizer solution | Griffin Greenhouse & Nursery Supplies, Newark, DE | 67-23-20 | Plant growing |
Lichenase Standard | Purified in house | Western blotting | |
MicroPulser Electroporator | BioRad, Hercules, CA | 165-2100 | Agrobacterium transformation |