I modsætning cellefrie HIV-1-partikler, er inficeret CD4 + T-celler effektivt registreres af plasmacytoide dendritiske celler (pdCs). Dette håndskrift beskriver en fremgangsmåde, hvor perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) eller isolerede pdCs dyrkes sammen med HIV-1-inficerede T-celler til at evaluere medfødte sensing af pdCs som vurderet ved frigivelse af type I-IFN.
HIV-1 medfødte sensing kræver direkte kontakt med inficerede CD4 + -T-celler med plasmacytoide dendritiske celler (pdCs). For at undersøge denne proces protokollerne her beskrevne anvendelse frisk isolerede humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) eller plasmacytoide dendritiske celler (pdCs) til at registrere infektioner i enten T-cellelinie (MT4) eller heterologe primære CD4 + T-celler. For at sikre korrekt registrering, er det vigtigt, at PBMC isoleres umiddelbart efter blodprøvetagning og at optimal procentdel af inficerede T-celler anvendes. Desuden kan multi-parametrisk flowcytometrisk farvning anvendes til at bekræfte, at PBMC prøver indeholder de forskellige cellelinier ved fysiologiske forhold. En række kontroller kan også være inkluderet for at evaluere levedygtighed og funktionalitet pdCs. Disse omfatter, tilstedeværelsen af specifikke overflademarkører, vurdere cellulære responser til kendte agonist af Toll-lignende receptorer (TLR) veje, og bekræfter manglende spontaneous type I interferon (IFN) produktion. I dette system, frisk isolerede PBMC'er eller pdCs dyrkes sammen med HIV-1-inficerede celler i plader med 96 brønde til 18-22 timer. Supernatanter fra disse co-kulturer anvendes derefter til at bestemme niveauerne for bioaktive type I-IFN'er ved at overvåge aktivering af ISGF3 vejen i HEK-Blue-IFN-a / p-celler. Før og under co-dyrkningsbetingelser, kan målceller underkastes flowcytometrisk analyse for at bestemme et antal parametre, herunder den andel af inficerede celler, niveauer af specifikke overfladearealer markører, og forskellen drab af inficerede celler. Selv disse protokoller oprindeligt blev udviklet til at følge type I-IFN produktion, kunne de potentielt bruges til at studere andre imuno-modulerende molekyler frigives fra pdCs og for at opnå yderligere indsigt i de molekylære mekanismer, der styrer HIV-1 medfødte sensing.
Type I-IFN-producerende pdCs repræsenterer den første linje i forsvaret mod virusinfektioner, og som sådan fungere som et vigtigt bindeled mellem medfødte og adaptive immunitet 1. Mens cellefrie HIV-1-partikler er dårligt påvises ved det medfødte immunsystem, er HIV-1-inficerede CD4 + T-celler effektivt registreres af pdCs 2. Sensing mekanisme kræver en indledende kontakt mellem det virale kappeglycoprotein (gp120) på overfladen af den inficerede T-celle og CD4-molekyler på pDC, som derefter følges af virus opsamling og internalisering af PDC. Efterfølgende anerkendelse af overført HIV-1 RNA ved TLR7 udløser aktivering af MyD88 / IRF7 sti og i sidste ende fører til type-I IFN produktion 3. Det er vigtigt, den anden aftaster pathway stede i pdCs, som medieres af TLR9, inhiberes ved interaktionen af det virale glycoprotein gp120, med pDC-specifikke overflade markør BDCA2 4.
<p class="jove_content"> De TLR7 og TLR9 sensing veje for pDC kan potentielt blive negativt moduleres af engagement BST2 (også betegnet Tetherin eller CD317) med en anden pDC-specifik overflade hæmmende receptor kaldet ILT7 5. BST2 udtrykkes ved høje niveauer på overfladen af pdCs og nogle kræftceller, men ved relativt lavere niveauer i andre celletyper, såsom B-celler, makrofager og T-celler. Det er vigtigt, kan BST2 induceres af type I-IFN i en række transformerede cellelinier samt i primære kulturer af humane og murine oprindelse 6. Bortset fra dens immun-regulerende funktion blev BST2 nylig fundet at inhibere frigivelsen af HIV-1 og andre indhyllet viruspartikler ved tværbinding vordende viruspartikler på den inficerede celleoverflade 7. I tilfælde af HIV-1 blev viruskodet accessorisk protein U (Vpu) vist sig at virke som en antagonist BST2. Det menes, at Vpu nedregulerer BST2 fra celleoverfladen af HIV-1-inficerede celler, stedet for dens tøjring aktivitet og som et resultat forbedrer viral frigivelse og spredning 7, selv om dette begreb er blevet udfordret 8,9. I mangel af Vpu, et stort antal fuldt dannet og moden afkom HIV-1-partikler tilbageholdes på celleoverfladen. Hvorvidt disse tøjrede partikler kunne repræsentere effektive mål for immun sensing stadig et åbent spørgsmål. Desuden er det uklart, om Vpu kunne dysregulate type I-IFN produktion fra pdCs ved at modulere overflade BST2 niveauer.Tidlige studier har til formål at vurdere HIV-1 sensing blev udført under anvendelse cellefrie HIV-1-partikler, som generelt anses for ringe inducere af type I-IFN 3,10-12. Eftersom nylige undersøgelser tyder på, at PBMC'er og pdCs fornemmer HIV-smittede CD4 + T-lymfocytter 2,13,14 effektivt, vi beskriver her en simpel metode til at måle medfødte reaktioner udløst af pdCs upon anerkendelse af HIV-1-inficerede celler in vitro.
De her beskrevne protokoller måle sensing af T-celler inficeret med GFP-mærkede HIV-1 virus, der kun afviger i deres evne til at udtrykke Vpu, som beskrevet i vores seneste rapport 18. Imidlertid kan disse metoder let modificeres til at studere føling af umærkede vira samt vira mangler andre virale gener, der potentielt modulerer medfødte sensing. Hvis de vira, der anvendes ikke udtrykker GFP, bør procentdelen af inficerede målceller bestemmes på anden måde, før co-kultur, som p24 (capsid) intracellulær farvning og flowcytometri eller ved p24-ELISA. Desuden kan disse protokoller anvendes med forskellige target-T-celler, herunder en række af tilgængelige cellelinier og primære celler.
De er beskrevet i dette manuskript metoder har en række fordele sammenlignet med tidligere metoder, der anvendes til at studere HIV-1 sensing. Først og fremmest er det blevet fastslået ved en række grupper, der cellefri HIV-1-partikler er dårlige inducere af type I-IFN 2,13,14. Desuden tidlige undersøgelser påberåbte ældre IFNa ELISA-baserede metoder til at kvantificere mængden af type I-IFN produceret. En begrænsning af denne afsløring teknik er, at de fleste af de ældre IFNa ELISA kits måler kun én type IFNa, mens udsigt andre typer af IFNa og IFNp. Anvendelsen af de beskrevne reporter cellelinjer overvinder denne begrænsning, da koncentrationen af alle bioaktive former for humane type I-IFN'er kan måles på én gang. Teknikken er meget følsom, billigere end den nye generation af IFN ELISA kit og for mange donorer let kan detekteres store mængder type I-IFN. Ikke desto mindre kan denne protokol nemt tilpasses til anvendelse med andre type I-IFN udlæsningssystemer metoder såsom ELISA'er.
Kritiske trin: Det er vigtigt, at kvaliteten af alle cellulære komponenter (både mål og effektorer) være tæt kontrolleret. Potentiel kontaminering, selv når asymptomatisk, skal overvåges og kontrolleres. Som vi tidligere nævnt, antibiotika-kontrolleret asymptomatisk bakteriel forurening, og potentielt andre intracellulære patogener, såsom mycoplasma, kan generere lignende immunresponser til dem observeret efter HIV-1 infektion, dvs. produktion af type I-IFN. Desuden er alle reagenser skal være fri for LPS eller andre potentielle endotoksiner. Ligeledes overvågning af PBMC'er og pdCs er også vigtig, da humane prøver ofte kan grundes med underliggende igangværende infektioner, der kan påvirke den normale sensing. Vi anbefaler altid herunder de foreslåede negative kontroller, såsom fravær af target-celler samt co-kulturer med mock-inficerede celler. Levedygtighed af inficerede celler er også vigtigt for korrekt pDC sensing siden type I-IFN ikke produceres efter co-kultur med apoptotiske celler 2,14.
En vigtig begrænsning i teknikken er behov for frisk isolerede primære celler. Denne procedure ikke vartestet ved hjælp af PBMC'er eller pdCs, der enten tidligere frosne eller holdes i kultur. Isoleringen af PBMC'er er arbejdskrævende, og disse celler har en meget begrænset levetid. Desuden bør standardprotokoller til beskyttelse mod patogen blodbårne bruges mens du arbejder med humant blod. Der er ofte flere kilder til variation i forbindelse med arbejde, der involverer frisk isolerede humane celler. Blandt dem er de forskellige procedurer, der gennemføres for at isolere disse celler, og den arvede variabilitet stødt fra donor-til-donor. Selv om det er umuligt at undgå mangfoldigheden af donor anvendelsen af de foreslåede positive kontroller, såsom måling af reaktion på kendte agonister for TLR7 TLR9 veje, vil give et vigtigt intern kontrol til disse eksperimenter. Vi observerede, at et stærkt respons på agonister af TLR9 pathway kunne korreleres med en sund pDC respons, mens en responsiv TLR7 pathway er nødvendig for en korrekt respons mod HIV-1 3.
<p class = "jove_content"> Baseret på observationer foretaget af os og andre 2, berigelse af pdCs fra PBMC'er ofte ikke nødvendig. Men hvis det eksperimentelle design kræver det (for eksempel i sammenhæng, hvor udtømning af specifikke PDC overflademarkører er nødvendigt) negativ udvælgelse er at foretrække i positiv selektion, som celler forbliver fri for antistof efter udvælgelsesprocessen. Isolerede pdCs undergår hurtige apoptose i kultur. Til forsøg, der kræver disse celler skal dyrkes i længere tid, kan dyrkningsmedier suppleres med IL-3. Dette cytokin inducerer pDC proliferation og hæmmer deres apoptose 16. Det er imidlertid nødvendigt IL-3 forbrug skal tæt kontrolleret, da det kan føre til pDC modning eller differentiering.Den her beskrevne metode kombinerer target HIV-1-inficerede celler med frisk isolerede PBMC'er eller pdCs for at genskabe de første skridt, der er involveret i medfødte sensing. Denne metode vil utvivlsomt være nyttigt at Explore tidlige medfødte immun hændelser forbundet med HIV-infektion. Selvom de tilhørende protokoller er rettet mod måling af type I-IFN, kunne de let modificeres til at måle andre bioaktive molekyler, der frigives fra pdCs efter genkendelse af inficerede celler. Disse kunne omfatte: Type-III IFN (IFN-λ), pro-inflammatoriske cytokiner (såsom TNF-α og IL-6) og kemokiner CXCL10, CCL4 og CCL5 17.
Vi takker E. Massicotte og J. Herren for ekspert teknisk bistand under flowcytometri og celle sortering eksperimenter. Også, vil vi gerne takke IRCM klinik personale og alle donorer for at give blodprøver. Blodprøver Perifere blev opnået fra raske voksne donorer, som gav skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen under forskningsprotokoller godkendt af forskningsetik gennemgang bestyrelsen for Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Følgende reagenser blev opnået gennem NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT4 celler fra Dr. Douglas Richman; og menneskelige rIL-2 fra Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc.
Dr. Cohen er modtageren af Canadas Research Chair i Human Retrovirology. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra CIHR (CIHR 111.226) til Dr. Cohen og fra Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) AIDS-netværk til Dr. Bego og Dr. Cohen.
MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
FBS | Wisent | 080-150 | |
Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc. |
Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
Equipment | |||
Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |