Till skillnad från cellfria HIV-1-partiklar, är infekterade CD4 + T-celler effektivt avkänns av plasmacytoid dendritiska celler (pDCs). Detta manuskript beskriver ett förfarande där perifera mononukleära blodceller (PBMC) eller isolerade pDCs är samodlade med HIV-1 infekterade T-celler för att utvärdera medfödd avkänning av pDCs såsom fastställts genom frisättning av typ I-IFN.
HIV-1 medfödd avkänning kräver direkt kontakt mellan infekterade CD4 + T-celler med plasmacytoid dendritiska celler (pDCs). För att studera denna process, de protokoll som beskrivs här använder färskt isolerade humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) eller plasmacytoid dendritceller (pDCs) att avkänna infektioner i antingen T-cellinje (MT4) eller heterologa primära CD4 + T-celler. För att säkerställa en korrekt avkänning, är det väsentligt att PBMC isoleras omedelbart efter bloduppsamling och att optimal procentandel av infekterade T-celler användes. Dessutom kan flera parametrisk flödescytometrisk färgning användas för att bekräfta att PBMC prover innehåller olika cellinjer vid fysiologiska förhållanden. Ett antal kontroller kan också inkluderas för att utvärdera lönsamheten och funktionalitet pDCs. Dessa innefattar, närvaron av specifika ytmarkörer, bedöma cellulära svar till känd agonist till Toll-liknande receptorer (TLR) vägar, och som bekräftar en brist på spontaneous typ I interferon (IFN) produktion. I detta system, nyligen isolerade PBMC eller pDCs är samodlade med HIV-1 infekterade celler i plattor med 96 brunnar för 18-22 timmar. Supematanter från dessa samodlingar används sedan för att bestämma halter av bioaktiva typ-I IFN genom övervakning av aktivering av ISGF3 vägen i HEK-Blue-IFN-a / P-celler. Före och under samtidig odlingsbetingelser, kan målceller genomgå flödescytometrisk analys för att fastställa ett antal parametrar, inklusive procentsatsen av infekterade celler, nivåer av specifika ytmarkörer, och differentiell dödande av infekterade celler. Även dessa protokoll ursprungligen utvecklats för att följa typ I IFN produktion, kan de potentiellt användas för att studera andra imuno-modulerande molekyler frigörs från pDCs och få ytterligare inblick i de molekylära mekanismer som styr HIV-1 medfödda avkänning.
Typ I IFN-producerande pDCs representerar den första försvarslinjen mot virusinfektioner, och som sådan fungerar som en viktig länk mellan medfödd och adaptiv immunitet 1. Medan cellfria HIV-1-partiklar är dåligt detekteras av det medfödda immunförsvaret, är HIV-1-infekterade CD4 ^ T-celler effektivt avkänns av pDCs 2. Den avkänningsmekanism förutsätter en initial kontakt mellan det virala höljesglykoproteinet (gp 120) vid ytan av den infekterade T-cellen och CD4-molekyler på PDC, som sedan följs av virus avskiljning och intemalisering av PDC. Efterföljande erkännande överförd HIV-1 RNA med TLR7 utlöser aktiveringen av MyD88 / IRF7 vägen och i slutändan leder till typ-I IFN produktion 3. Viktigt är det andra avkänningselementet vägen närvarande i pDCs, som förmedlas genom TLR9, inhiberas genom samverkan av det virala glykoproteinet, gp 120, med PDC-specifik ytmarkör BDCA2 4.
<p class="jove_content"> De TLR7 och TLR9 avkänning vägar pDC kan potentiellt negativt moduleras av engagemang BST2 (även betecknad Tetherin eller CD317) med en annan pDC-specifik yta hämmande receptor kallad ILT7 5. BST2 uttrycks vid höga nivåer på ytan av pDCs och vissa cancerceller, men vid relativt lägre nivåer i andra celltyper, såsom B-celler, makrofager och T-celler. Viktigt kan BST2 induceras av typ-I IFN i ett antal transformerade cellinjer liksom i primära cellkulturer av humana och murina ursprung 6. Bortsett från dess immunreglerande funktion, BST2 nyligen visat sig hämma frisättningen av HIV-1 och andra insvept viruspartiklar av tvärbindnings begynnande viruspartiklar på den infekterade cellytan 7. I fallet med HIV-1, var viruskodat accessoriskt protein U (Vpu) visat sig fungera som en BST2 antagonist. Man tror att Vpu nedreglerar BST2 från cellytan av HIV-1-infekterade celler, platsen för dess tjudering aktivitet och som ett resultat ökar viral utsläpp och sprida 7, även om detta begrepp har ifrågasatts 8,9. I frånvaro av Vpu, ett stort antal helt formad och moget avkomma HIV-1-partiklar hålls kvar vid cellytan. Huruvida dessa bundna partiklar kan utgöra effektiva mål för immunanalys är fortfarande en öppen fråga. Dessutom är det oklart om Vpu kan dysregulate typ I IFN produktion från pDCs genom att modulera ytan BST2 nivåer.Tidiga studier för att utvärdera HIV-1 avkänning genomfördes med användning cellfria HIV-1-partiklar, som i allmänhet anses dåliga inducerare av typ I-IFN 3,10-12. Med tanke på att nya studier tyder på att PBMC och pDCs känner effektivt HIV-infekterade CD4 + T-lymfocyter 2,13,14, beskriver vi här en enkel metod för att mäta medfödda svar utlöses av pDCs vid erkännande av HIV-1-infekterade celler in vitro.
De protokoll som beskrivs här mäta avkänning av T-celler som infekterats med GFP-märkta HIV-1-virus som skiljer sig endast i deras förmåga att uttrycka Vpu, som beskrivs i vår senaste rapport 18. Däremot kan dessa metoder lätt modifieras för att studera avkänning av omärkta virus samt virus som saknar andra virusgener som potentiellt skulle kunna modulera medfödda avkänning. Om de virus som används inte uttrycker GFP, bör andelen infekterade målceller bestämmas på annat sätt före co-kultur, såsom p24 (kapsid) intracellulär färgning och flödescytometri eller p24 ELISA. Vidare kan dessa protokoll användas med olika mål-T-celler, innefattande en mängd olika tillgängliga cellinjer och primära celler.
De metoder som beskrivs i detta manuskript har ett antal fördelar jämfört med tidiga metoder som används för att studera HIV-1 avkänning. Först och främst har fastställts genom ett antal grupper som cellfria HIV-1 partiklar är dåliga inducerare av typ-I IFN 2,13,14. Dessutom tidiga studier förlitat sig på äldre IFNa ELISA-baserade metoder för att kvantifiera mängden av typ I IFN produceras. En begränsning med denna detektionsteknik är att de flesta av de äldre IFNa ELISA-satser mäter endast en typ av IFNa, medan utsikt de andra typerna av IFNa och IFNp. Användningen av de beskrivna reporter cellinjer vinner denna begränsning när koncentrationen av alla bioaktiva former av humana typ I interferoner kan mätas på en gång. Tekniken är mycket känslig, billigare än den nya generationen av IFN ELISA-kit och för många givare stora mängder av typ-I IFN kan lätt upptäckas. Ändå kan detta protokoll enkelt anpassas för användning med andra typ I IFN utlästa metoder såsom ELISA.
Kritiska steg: Det är viktigt att kvaliteten på alla cellulära komponenter (både mål och effektenheter) vara hårt kontrollerad. Potentiell förorening, även när asymptiska, måste övervakas och kontrolleras. Som vi tidigare nämnt, antibiotika styrda asymtomatisk bakteriell kontamination, och eventuellt andra intracellulära patogener såsom mykoplasma, kan generera liknande immunsvar mot dem som observerades efter HIV-1-infektion, nämligen produktion av typ I IFN. Dessutom är alla reagens måste vara fria från LPS eller andra potentiella endotoxiner. På samma sätt är också viktigt övervakning av PBMC och pDCs sedan prover från människa ofta kan förberedas genom att underliggande pågående infektioner, som kan påverka normal avkänning. Vi rekommenderar alltid inklusive de föreslagna negativa kontroller, till exempel avsaknad av målceller samt samkulturer med skeninfekterade celler. Livskraft infekterade celler är också viktigt för korrekt pDC avkänning eftersom typ-I IFN inte produceras efter samodling med apoptotiska celler 2,14.
En viktig begränsning av tekniken är behovet av nyisolerade primära celler. Detta förfarande var intetestas med användning av PBMC eller pDCs som antingen tidigare frysta eller hålls i kultur. Isoleringen av PBMC är arbetskrävande och dessa celler har en mycket begränsad livslängd. Dessutom bör standardprotokoll för att skydda mot blodburna patogener användas när du arbetar med humant blod. Det finns ofta flera källor till variabilitet i samband med arbete som involverar färskt isolerade humana celler. Bland dem är de olika förfaranden som genomförs för att isolera dessa celler, och den övertagna variabiliteten stött från donator till donator. Även om det är omöjligt att undvika variationsrikedomen bland givare, användningen av de föreslagna positiva kontroller, såsom mätning svar på kända agonister av TLR7 och TLR9 vägar, skulle ge en viktig intern kontroll för dessa experiment. Vi observerade att en robust svar på agonister av TLR9 vägen kan korreleras med en hälsosam pDC svar, medan en lyhörd TLR7 väg krävs för ett korrekt svar mot HIV-1 3.
<p class = "jove_content"> Baserat på observationer gjorda av oss och andra 2, ofta inte behövs anrikning av pDCs från PBMCs. Men om experimentell design kräver (till exempel i samband med där det behövs utarmning av specifika PDC ytmarkörer) negativ selektion är att föredra framför positiv selektion, som celler förblir fria från antikroppar efter urvalsprocessen. Isolerade pDCs genomgår snabb apoptos i kultur. För experiment som kräver dessa celler som skall odlas för längre tid, kan odlingsmedier kompletteras med IL-3. Denna cytokin inducerar pDC proliferation och hämmar deras apoptos 16. Behöver dock IL-3 användning för att vara hårt kontrollerad, eftersom det kan leda till pDC mognad eller differentiering.Den här beskrivna metoden kombinerar mål HIV-1-infekterade celler med nyisolerade PBMC eller pDCs för att återskapa de initiala steg som är involverade vid medfödd avkänning. Denna metod kommer utan tvekan att vara till nytta för explore tidiga medfödda immun händelser i samband med HIV-infektion. Även om tillhörande protokoll syftar till att mäta typ-I IFN, kunde de lätt ändras för att mäta andra bioaktiva molekyler frigörs från pDCs vid erkännande av infekterade celler. Dessa kan omfatta: typ III IFN (IFN-λ), pro-inflammatoriska cytokiner (t.ex. TNF-α och IL-6) och kemokinerna CXCL10, CCI4 och CCL5 17.
Vi tackar E. Massicotte och J. Lord för teknisk experthjälp under flödescytometri och cellsortering experiment. Dessutom skulle vi vilja tacka IRCM kliniken personal och alla givare för att ge blodprov. Perifera blodprover erhölls från friska vuxna givare som gav skriftligt informerat samtycke i enlighet med Helsingforsdeklarationen i forskningsprotokoll som godkänts av forskningsetikprövningsnämnd av Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Följande reagens erhölls genom NIH AIDS Reagens Program, Avdelningen för aids, NIAID, NIH: MT4-celler från Dr. Douglas Richman; och mänskliga rIL-2 från Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc.
Dr Cohen är mottagare av Kanada forskning ordförande i Human Retrovirology. Detta arbete har finansierats med bidrag från CIHR (CIHR 111226) till Dr. Cohen och från Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) AIDS nätverk till Dr. Bego och Dr Cohen.
MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
FBS | Wisent | 080-150 | |
Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc. |
Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
Equipment | |||
Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |