マウスモデルにおける子宮卵管胚移植と精管切除
Summary
子宮卵管胚移植は、子宮の転送を実行するときに発生する可能性があり、胚の流出を防止するためのバリアとして子宮卵接合を使用しています。精管切除雄は、胚移植のための偽妊娠レシピエントを得るために必要とされる。両方の技術が議論されている。
Abstract
サロゲートメス着床前の胚の転送は、その後の胎児の発育と成人健康上の着床前の開発中に発信し遺伝子改変マウスを製造するための、またはエピジェネティックな変化の影響を研究するために必要なステップです。効果的かつ一貫性のある胚移植技術の使用は、遺伝子改変動物の発生を増強する用語に移植率及び生存率に対する異なる処理の効果を決定するために重要である。胚盤胞期の胚は、通常、胚操作ピペットを導入するために子宮壁内の穿刺を行い、子宮転送により転送される。ピペットが取り下げられた、胚による子宮の正圧に腹腔へ流出することができた後に子宮に行わオリフィスは閉じません。パンクにも、移植性を損なう出血を生成することができ、ブロック転送ピペットおよび胚Dに影響を与える可能性が透明帯のない胚が転送され、特にevelopment、。従って、この技術は、しばしば非常に可変と全体的に低い胚の生存率をもたらす。これらの負の影響を回避、子宮卵管胚移植、胚流出を妨げる天然バリアとしての子宮卵管接合を利用して、子宮壁の穿刺を避ける。精管切除した雄は、偽妊娠の受信者を取得するために必要とされる。精管切除を行うための技術が子宮卵管胚移植を補完するものとして記載されている。
Introduction
胚移植は、おそらくマウスモデルで実行される最も頻繁な外科的処置である。この技術は、 インビトロでの操作技術に供胚から子孫を得ることが不可欠であり、したがって、前核注入、レンチウイルス形質導入、またはキメラ形成による遺伝的に改変されたモデルの開発のために必要なステップを構成している。しかも、この技術は、着床前の開発中に発生する多様な侮辱の発達への影響の研究を可能にする。人工生殖技術1または別の物質または代謝物2の異常な濃度への暴露の使用は、移植や胎盤形成の障害と子孫における長期的な効果をもたらした胚の発達に影響を及ぼす可能性があります。信頼性と再現性胚移植技術は、一貫性のある人間に移植すると、胎児の発育に関する実験的治療の可能性のあるマイナスの効果をテストすることが重要であるNER。
マウス着床前胚は、0.5日後に交尾の膨大部（DPC）偽妊娠レシピエント（卵管転送）3,4または2.5のDPC偽妊娠レシピエントの子宮に（子宮転送）5,6を経由して卵管にどちらレシピエント雌に転送することができます彼らの発達段階に応じて。このような胚または誘導多能性幹細胞の注入によってキメラマウスを生成するために使用されるもののような胚盤胞段階の胚は、通常、子宮転送により転送される。胚盤胞は、また0.5 DPC受信者の卵管に転送することができますが、胚は休眠を受け、注入が行われる前に発作から回復する2日間を持っているので、それは、発達かく乱にはあまり生理的テストを構成している。子宮内移植は、子宮腔への胚操作ピペットのアクセスを可能にする開口部を生成するために、狭い針で子宮壁に穴をあけることを含む。 Althoughこの技術は良い結果を得ることができ、長期の生存が（ つまり PUPに開発移植胚の割合）は、多くの場合、低および7,8予測不可能である。
子宮壁の穿刺は、いくつかの有害な副作用を伴う。まず、子宮筋層が高度に血管組織であり、その穿刺は、多くの場合、小さな出血が生じる。血液は胚移植ピペットをブロックしたり、胚の死および/または着床不全の原因となる子宮内腔に侵入することができる。血液細胞および破片が割球に取り付けることができるように、 透明帯のない胚は、転送されるとき、これは特に関連する。胚が転送された後第行わ開口は密封しないので、オリフィスを通って流れることができ、大きすぎる体積が子宮内に導入されたときに腹腔に排出される。ここに記載さ子宮卵管胚移植はEMBRを提供するために子宮卵管接合を利用する子宮壁を穿刺し、それによってその有害な結果9を回避する必要なく、子宮へヨーヨー。
胚移植のために使用偽妊娠レシピエント雌を精管切除した雄8と自然交配により得られる。雄性不稔で生成精液の分泌物が移植胚を受け入れるになるために子宮のために必要とされる。受信者を取得するには、生後6ヶ月〜8週間の2人の女性の最大は午後精管切除雄と配置されます。翌朝、雌を膣交尾プラグ、雄精液から凝固タンパク質の塊の存在がチェックされます。交配は通常、深夜中に発生するように、膣プラグ検出の日は0.5 DPCであると考えられている。精管切除した雄は、いくつかのベンダーから購入することができますが、ここに記載さの外科的処置は、比較的容易であり、胚移植のために必要とされるよりも、追加の機器を必要としない。
Protocol
Representative Results
Discussion
精管切除は大きな困難を伴わない比較的単純手術法である。ポビドンヨード、エタノールで消毒した場合は、それが腹膜を刺激する可能性がある（エタノールによる）最後の洗浄は、ポビドンヨードを削除していることを確認してください。 輸精管へのアクセスはまた、陰嚢または腹部8の横方向の切開を行うことによって達成することができる。陰嚢切開は、必要に応じて、…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、BTの動物や鳥科学省からの資金によって支えられている。
Materials
| Ketamine | VEDCO | Ketaved ANADA 200-257 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Xylazine | Lloyd laboratories | Anased NADA #139-236 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buprenorphine | Generic | NDC 400-42-010-01 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Eye ointment | Novartis | Genteal | |
| Antibiotic | Pfizer | Clavamox NADA #55-101. | Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water. |
| Dressing serrated forceps | ROBOZ | RS-8120 | Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work. |
| Micro dissecting serrated forceps | ROBOZ | RS-5137 | These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred. |
| Slight curved micro dissection forceps | ROBOZ | RS-5136 | This model is particularly useful to hold the oviduct. |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| 27G needles | Beckton-Dickinson | 305136 | Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big. |
| Clip applier | MiKRon | 42763 | |
| 9 mm Clips | MiKRon | 427631 | |
| Clip remover | MiKRon | 7637 | Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead. |
| Suture needle holder | ROBOZ | RS-7820 | |
| Suture | Dowist Gell | 5-0 Dexon S 7204-21 | Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle. |
| Glass capillaries | VWR | 100 ul calibrated pipettes 53432-921 | It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8. |
| Burner | KISAG AG | Typ 2002 | Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame. |
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. |
| Fiber optics ilumination | Dolan Jenner | Fiber lite | To iluminate the surgical area. There are different systems available. |
| Warm stages | American scope | http://store.amscope.com/tcs-100.html | These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked. |
| Culture dishes for embryo manipulation | Falcon | 353001 | 351008 may be also used, they made narrower drops. |
References
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