Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

Summary

Ce protocole détaille un test destiné à mesurer la chimiotaxie des neutrophiles humaine d'une gouttelette de sang total avec une reproductibilité robuste. Cette approche évite la nécessité d'une séparation des neutrophiles et ne nécessite que quelques minutes de test de temps de préparation. La puce microfluidique permet la mesure répétée de la chimiotaxie des neutrophiles au fil du temps chez les nourrissons ou les petits mammifères, où le volume de l'échantillon est limité.

Abstract

Les neutrophiles jouent un rôle essentiel dans la protection contre les infections et leur nombre dans le sang sont souvent mesurés à la clinique. Le nombre de neutrophiles plus élevés dans le sang sont généralement un indicateur des infections en cours, tandis que faible numération des neutrophiles sont un signe d'alerte pour des risques plus élevés pour les infections. Pour accomplir leurs fonctions, les neutrophiles doivent également être en mesure de se déplacer efficacement dans le sang où ils passent la plupart de leur vie, dans les tissus, où les infections se produisent. Par conséquent, tous les défauts de la capacité des neutrophiles de migrer peuvent augmenter les risques d'infections, même lorsque les neutrophiles sont présents en nombre suffisant dans le sang. Toutefois, la mesure de la capacité de migration des neutrophiles dans la clinique est une tâche difficile, qui prend du temps, nécessite volume important de sang, et les connaissances d'experts. Pour répondre à ces limitations, nous avons conçu un solide tests microfluidiques pour la migration des neutrophiles, qui nécessite une seule goutte de sang non traité, circumévents la nécessité d'une séparation des neutrophiles, et est facile à quantifier sur un simple microscope. Dans ce dosage, les neutrophiles migrent directement à partir de la goutte de sang, à travers de petits canaux, vers la source de chimio-attractif. Pour éviter que le flux granulaire de globules rouges par la même voie, nous avons mis filtres mécaniques avec des virages à angle droit qui bloquent sélectivement l'avance de globules rouges. Nous avons validé le test en comparant la migration des neutrophiles de gouttelettes de sang prélevés de piqûre au doigt et le sang veineux. Nous avons également comparé les sang total (WB) sources de la migration des neutrophiles à partir d'échantillons de neutrophiles purifiés et trouvé une vitesse constante et la directionnalité entre les trois sources. Cette plate-forme microfluidique permettra l'étude de la migration des neutrophiles humain dans la clinique et le contexte de la recherche pour faire avancer notre compréhension des fonctions des neutrophiles dans la santé et la maladie.

Introduction

trafic de neutrophiles joue un rôle déterminant dans l'évolution et la résolution de nombreuses affections inflammatoires, y compris l'athérosclérose ^1, infection bactérienne ou une septicémie ^2, et ³ de brûlures. Pour leur importante contribution à des conditions de santé et de maladie, le nombre de neutrophiles est partie de l'analyse de sang norme souvent considéré dans les laboratoires cliniques et de recherche. Toutefois, en dépit d'être l'un des tests les plus répandus, la valeur de la numération des neutrophiles dans le diagnostic de l'infection et de septicémie a été souvent interrogé ^4.

Protocol

1. Microfluidique fabrication de périphériques

1. En utilisant des techniques de photolithographie standard fabriquer le moule maître plaquette dans une salle blanche de classe 1000. Motif du premier 3-um-mince couche de résine photosensible négative à base d'époxy pour définir les voies de migration selon les instructions du fabricant. Motif de la deuxième couche de 50 um d'épaisseur pour définir les cellules de chargement et de chimiokines chambres.
2. Utilisez la plaquette motifs de jeter polydiméthylsiloxane appareils (PDMS). Mélanger vigoureusement PDMS (20 g) avec un initiateur (2 g) pendant 5 minutes en utilisant une fourchette en plasti....

Results

Le sang total (WB) essai de chimiotaxie des neutrophiles a été validé par la mesure de l'accumulation des neutrophiles vers un gradient fMLP (Film S1). Les résultats confirment que les globules rouges sont piégés par le peigne de filtration alors que les neutrophiles (bleus) sont capables de migrer activement sur ​​sang total (Figure 3A et Movie S1). Le gradient linéaire stable chimiotactique (vert), formé par l'ensemble du dispositif de microfluidique de sang a été con.......

Discussion

Dans ce travail, nous avons développé une plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles à partir d'une goutte de sang (2 pi). La filtration sur puce mécanique des globules rouges à partir de la migration des neutrophiles activement contourne le besoin de méthodes lourdes de séparation de cellules telles que les gradients de densité ^{10, 11} sélection positive, la sélection négative ou ^12, qui sont susceptibles d'introduire des artefacts en activant les neutrophiles. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Lames de verre standard	Fisher Scientific	125495	1 X 3 pouces
Plaque à fond en verre	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, diamètre de la pointe 5,0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, diamètre de la pointe 1,5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Préparation et analyse des dosages microfluidiques
Pointe de pipette à chargement de gel	Fisher Scientific	02-707-139
Seringue	Fisher Scientfic	309602
Aiguille à pointe émoussée, 30 G ½ ; in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Héparine	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
humain albumine	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0,2 % de concentration finale dans HBSS
Fibronectine	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
Lancette de sécurité SurgiLance, profondeur 2,2 mm, 22 G		SLN240
Coloration Hoescht	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Kit d’enrichissement en neutrophiles humains	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Four	Thermo Scientific	13-258-30C
Pince à épiler de précision en acier inoxydable	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Dessiccateur sous vide résistant aux produits chimiques	Fisher Scientific	08-594-15A
Plaque chauffante numérique	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE microscope inversé	Nikon - Micro Video Instruments Inc.
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objectif	Nikon - Micro Video Instruments Inc.
lumen 200 avec guide de lumière de 2 mètres pour Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Excitateurs à bande étroite 32 mm - Émetteurs 25 mm	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 Caméra CCD refroidie 1 600 x 1 200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C