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Neurosciences

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

Published: June 15, 2014
doi:
10.3791/51219
, ,
1Regenerative Medicine Institute,Cedars-Sinai Medical Center

Summary

이 프로토콜은 단일 세포 현탁액 분해없이 구형 신경 줄기 및 전구 세포 응집체의 확장을 허용 신규 기계적 자르고 방법을 설명한다. 세포 / 세포의 접촉을 유지하는 것은 40 구절에 대한 신속하고 안정적​​인 성장을 할 수 있습니다.

Abstract

실험 연구와 임상 시험을위한 단일 시료로부터 세포의 큰 숫자를 축적하는 셀 확장 기술은 크게 줄기 세포 사회를 유익 것이다. 현재의 많은 확장 방법은 힘들고 비용이 많이 드는, 완전한 분리를 포함하는 여러 줄기 및 전구 세포 유형의 분화 또는 초기 노화를 받아야하는 원인이 될 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 간단하고 저렴하다 "마"라 자동화 기계류 계대 방법을 개발했다. 이 기술은 단일 세포로 화학 물질 또는 효소 분해를 방지하고 대신 상수 세포 / 세포 접촉을 유지 정지, 회전 타원체 문화의 대규모 확장 할 수 있습니다. 초핑 방법은 주로 태아 뇌 유래 신경 전구 세포 또는 neurosphere를 위해 사용되었으며, 최근 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래의 신경 줄기 세포를 사용하기 위해 발행되었다. 프로 시저 involv에스 조직 문화 배양 접시에 neurosphere를 파종 이후에 효과적으로 수동으로 기계적으로 각 영역을 해리의 지루한 과정을 자동화 세포를 통해 날카로운, 멸균 블레이드를 전달합니다. 문화의 세포를 일시 중단하면 유리한 표면적 – 부피 비율을 제공한다; 500,000 이상의 세포는 직경이 0.5 mm 미만의 단일 neurosphere 내 성장시킬 수있는. 한 T175 플라스크에서 50 백만 셀은 1500 만 자기편 문화에 비해 서스펜션 문화에서 성장할 수 있습니다. 중요한 것은, 마 절차는 임상 수준의 세포 제품의 대량 수량의 생산을 허용, 현재 좋은 제조 연습 (cGMP의)에서 사용되어왔다.

Introduction

단층 1-3 또는 집계 neurosphere를 4-7 중 하나로 문화에 쥐 신경 줄기 세포 확장의 긴 역사가있다. 또, 현상 중추 신경계 8-17의 다양한 영역들로부터 격리 된 인간 신경 전구 세포 (hNPCs)는 시험 관내에서 확장되었다. 이 세포는 이중 강력한, 성상 세포 및 신경 세포 모두로 분화 할 수 있으며 신경 발달 (18, 19)과 질병 메커니즘 (20, 21)를 연구에 매우 유용한 도구가되고있다. hNPCs도 통합, 생존 및 기능 효과 22-24 다양한 수준의 중추 신경계 질환의 다양한 동물 모델에 이식되었다.

종종 표피 성장 인자 (EGF) 및 / 또는 섬유 아세포 성장 인자 -2 (FGF-2) 25 ~ 28 – – 및 접착 29 세 모두 전통적 설치류 또는 인간 태아 유래의 NPC가 성장 인자에 노출되어차원 타원체 시스템은 일반적으로 단일 세포 현탁액 30-34로 효소 적 분해를 사용하여 계대된다. 연구 또는 임상 사용을위한 세포를 확장하는 표준 방법은 쉬운 조작에 의한 부착 단층과 같다. 그러나, 우리는 효소 또는 화학 솔루션 계대 단층과 neurosphere hNPCs 초기 노화 35의 결과 것으로 나타났습니다. 또한, 효소 분해는 배아 줄기 세포 36-38 시연 데이터를 기반으로 차별화와 핵형 이상 수준 증가의 원인이 될 수 있습니다. 계대의 hNPCs의 표준 방법은 현재 우수 제조 단계로 1 임상 시험 (세포에게 주식, Neuralstem 주식 줄기) 갈 (의 cGMP) 수준의 제품을 생산하고 있지만,이 방법은 제한, 세포의 증폭 만 몇 라운드를 허용하는 잠재력을 은행.

분명, 많은 연구 실험 및 향후 임상 시험 할 수있는 기능 혜택을 누릴 수대규모 성장 및 세포 은행을 허락 대량 지​​연된 노화와 세포를 전파. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 세포 간 접촉을 유지하기 위해 작은 클러스터로 그들을 "마"의 소설 기계적으로 계대 손상을 neurospheres의 자동화 된 방법을 개발했다. 이 방법은 크게 다른 3D 생물 반응기 배양 방법 (40)으로 된 것과 같이 그들의 수명 (39) 및 현탁 배양은, 단층 배양에 비해 인큐베이터 공간을보다 효율적으로 사용할 수있게 증가 하였다. 제공된 마 프로토콜은 통로 (10), 표준 계대 방법을 사용하여 가능성 위업보다 한 태아의 샘플에서 대형 은행의 생산을 할 수 있습니다. 계대의 hNPCs이 방법은 틀에 얽매이지 않는 동안, 인기가 증가하고 있으며, 최근에는 이러한 인간의 배아와 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 신경 줄기 세포 등 다른 세포 유형, V IN 등 다양한 애플리케이션을위한 대규모 확장을 가능으로 출판되었다나이트로 질환 모델링 41-46. 중요한 것은,의 cGMP 급 hNPC 세포 은행은 이미 기술이 미래의 임상 응용으로 적용 할 수 있다는 것을 보여 마 방법으로 생산되고 있습니다.

Protocol

1. 윤리 정책 및 안전 이 절차는 인간 또는 동물 유래의 세포 배양 제품의 사용을 포함한다. 모든 파생 된 조직은 해당 기관 검토위원회 (들) 및 / 또는 기관 동물 케어 및 사용위원회 (들)에 의해 사용하기 전에 승인을 받아야합니다. 모든 생물의 유해 폐기물은 각각의 기관에서 결정한 안전 규정에 따라 처리해야합니다. 알이 절차를 통해 apposite 안전 및 폐기의 모든 지침을 따르십?…

Representative Results

P19 냉동 hNPCs의 그림 5. 대표 데이터.) 예상 세포 수는 다음 해동 마 방법을 통해 계대 neurosphere를 비교하여 효소 분해를 사용하여 부착 단일 층으로 확장. 세포가 P20에 해동했을 때 일 0 나타냅니다. B) 분야의 대표 이미지를 미리 잘라, 구 후 절단, 10X. D)<…

Discussion

그림 6
그림 6. 마 회로도. 기계적 마 방법을 사용하여 문화 구형 줄기 / 전구 세포를 확장.

중요한 단계

마 팽창 패러다임의 개요. hNPC 구면 사이즈을 neurospheres 계대 전에 관찰하는 중요한 기준 중 하나가도 6에 도시된다. ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 중요한 검토 및 본 보고서의 편집을 위해 박사 Soshana Svendsen은 감사합니다. 이 작품은 NIH / NINDS 1U24NS078370-01 및 CIRM DR2A-05320에 의해 기여했다.

Materials

Beaker, 50 mL Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 mL Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 mL BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer  Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 mL Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37°C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1 – 10 μL Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μL AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1000 μL AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μL AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μL AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1X) Life Technologies 12563-011
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References

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Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).
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