L'approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine
Summary
En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.
Abstract
La chromatine est un complexe de nucléoprotéine hautement dynamique faite de l'ADN et des protéines qui contrôle divers procédés d'ADN-dépendante. la structure de la chromatine et de la fonction à des régions spécifiques est régie par l'enrichissement local du histones modifications post-traductionnelles (hPTMs) et variantes, les protéines de la chromatine de liaison, y compris les facteurs de transcription, et méthylation de l'ADN. La caractérisation protéomique de la composition de la chromatine au niveau des régions fonctionnelles distinctes a été jusqu'ici entravé par le manque de protocoles efficaces pour enrichir ces domaines à la pureté et la quantité appropriée pour l'analyse en profondeur ultérieure par spectrométrie de masse (MS). Nous décrivons ici une stratégie de protéomique de la chromatine nouvellement conçu, nommé ChroP (Chro matin P roteomics), dans lequel une immunoprécipitation de la chromatine préparative est utilisée pour isoler les régions de la chromatine distincts dont les caractéristiques, en termes de hPTMs, variantes et co-associés protéines non histoniques, sont analysés par MS. Nous illustrons ilre la mise en place de ChroP pour l'enrichissement et l'analyse des régions d'hétérochromatine transcriptionnellement silencieux, marqué par la présence de tri-méthylation de la lysine 9 sur l'histone H3. Les résultats obtenus démontrent le potentiel de ChroP pour caractériser complètement le protéome de l'hétérochromatine et prouver comme une stratégie analytique puissant pour comprendre comment les déterminants de protéines distinctes de la chromatine et interagissent en synergie pour établir les configurations structurelles et fonctionnelles spécifiques de locus.
Introduction
La chromatine est un complexe nucléoprotéine très dynamique qui est impliqué en tant que modèle primaire pour tous les processus médiés par ADN. Le nucléosome est l'unité répétée de base de la chromatine et est constitué d'un noyau protéique octamère contenant deux molécules de chaque histone H2A canonique, H2B, H3 et H4, autour de laquelle 147 pb d'ADN sont enroulées 1,2. Tous les histones sont structurées comme un domaine globulaire et une "queue" N-terminal flexible qui fait saillie à l'extérieur du nucléosome. L'un des principaux mécanismes de régulation de la structure de la chromatine et la dynamique est basé sur covalentes modifications post-traductionnelles (PTM), qui se produisent principalement sur l'extrémité N-terminales des histones 3,4. modifications des histones peuvent fonctionner soit en modifiant la structure de la chromatine afin supérieur, en changeant les contacts entre les histones-ADN ou entre nucléosomes, et de contrôler ainsi l'accessibilité des protéines de liaison à l'ADN (mécanismes cis), ou en agissant comme DockInsites g de protéines de régulation, soit comme des unités simples ou intégrés dans des complexes multimériques. De telles protéines de régulation peuvent exercer leur fonction de différentes façons: en modulant directement l'expression du gène (à savoir les protéines TAF), ou en modifiant le positionnement des nucléosomes (c'est à dire le remodelage de la chromatine des complexes) ou en modifiant d'autres résidus d'histones (par exemple des protéines avec des méthyl-transférase ou l'acétyl- transférase) (mécanismes trans) 5. L'observation que distincte grappe des modèles PTM à la chromatine locus spécifique conduit à l'élaboration de l'hypothèse que les différentes modifications dans des sites distincts en synergie pour générer un code moléculaire médiation de l'état fonctionnel de l'ADN sous-jacente. Le "code histone hypothèse" a acquis un large consensus dans les années, mais sa vérification expérimentale a été freinée par des contraintes techniques 6,7.
Protéomique à base de spectrométrie de masse (MS) a émergé comme unoutil puissant pour cartographier la distribution de modification des histones et de caractériser les protéines de la chromatine liaison 8. MS détecte une modification comme une Δmass spécifique entre la masse expérimentale et théorique d'un peptide. Au niveau des histones individuelles, MS fournit une méthode objective et globale de la carte MEA, permettant la détection de nouvelles modifications s'enchaînant révélateurs parmi eux 9-14.
Au cours des dernières années, un certain nombre de stratégies ont été développées pour disséquer la composition de la chromatine protéomique, y compris la caractérisation de chromosomes intacts mitotiques, 15 l'identification de protéines solubles de liaison à Hptm 16-18 et l'isolement et l'analyse des régions spécifiques de la chromatine (par exemple télomères) 19,20. Toutefois, l'enquête des synergies spécifiques de locus entre MEA histones, les variants et les protéines de la chromatine associée est encore incomplète. Ici, nous décrivons une nouvelle approche, appelée ChroP (Chro roteomics matin P) 21, que nous avons développés pour caractériser efficacement les domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes. Cette approche s'adapte immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), un protocole bien établi, utilisé dans la recherche en épigénétique, pour l'analyse protéomique MS efficace de l'échantillon enrichi. Nous avons mis au point deux protocoles différents, en fonction du type de la chromatine utilisée comme entrée et l'interrogation adressée par MS; en particulier: 1) morceau de la chromatine native non fixée digéré avec MNase est utilisé pour purifier mono-nucléosomes et à disséquer les hPTMs co-associant (N-ChroP); 2) à puce de la chromatine réticulée fragmenté par ultrasons est utilisé en combinaison avec un interactomique stratégie basée sur SILAC à caractériser toutes les protéines (X-ChroP) contraignant la chromatine co-enrichissement. Nous illustrons ici la combinaison de N-et X-ChroP pour enrichir et d'étudier l'hétérochromatine, en utilisant H3K9me3 comme appât pour les étapes d'immunoprécipitation. L'utilisation de ChroP peut être étendud'étudier soit des régions distinctes sur la chromatine, ou des changements dans la composition de la chromatine dans la même région au cours de la transition à un état fonctionnel différent, ouvrant ainsi la voie à de nombreuses applications dans l'épigénétique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons récemment décrit ChroP, une stratégie pour la caractérisation quantitative à grande échelle des composants protéiques de la chromatine. ChroP combine deux approches complémentaires utilisés dans le domaine de l'épigénétique, la puce et MS, profitant de leurs points forts et de surmonter leurs limitations respectives. ChIP couplé à un séquençage profond (ChIP-Seq) permet la cartographie du génome de modifications des histones à la résolution de quelques nucléosomes 35. Bien a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été publié à l'origine dans Mol Cell Proteomics. Soldi M. et T. Bonaldi La protéomique enquête de la chromatine domaines fonctionnels Révèle nouveaux Synergismes entre Distinct hétérochromatine Composants MCP. 2013; 12: 64-80. © l'American Society for Biochemistry and Molecular Biology. Nous remercions Roberta Noberini (Institut Italien de Technologie et l'IEO, Italie) pour la lecture critique du manuscrit. travail de la tuberculose est soutenu par des subventions du-Armenise Harvard Programme Giovanni Fondation de développement de carrière, l'Association italienne pour la recherche du cancer et le ministère italien de la Santé. Travail MS a été soutenue par une bourse FIRC.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
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