I Vivo siRNA Transfection og Gene Knockdown i Spinal Cord via Rapid Noninvasiv Lumbar Intratekal Injeksjoner i Mus

Summary

Denne rapporten beskriver en enkel og rask teknikk av intratekal nålestikk for en lokalisert transfeksjon av siRNA i ryggmargen i mus på korte varig lett anestesi.

Abstract

Denne rapporten beskriver en steg-for-steg guide til teknikken for akutte intratekal nål injeksjoner i en ikke-invasiv måte, det vil si uavhengig av kateter implantasjon. Den tekniske begrensning av denne kirurgiske teknikken ligger i finesse av hendene. Injeksjonen er rask, spesielt for en trent eksperimentator, og siden vevsdesintegrasjon med denne teknikken er minimal, gjentatte injeksjoner er mulig, dessuten immunreaksjon på utenlandske verktøy (. F.eks kateter) ikke forekommer, og dermed gi en bedre og mer spesifikke lese ut i ryggmarg modulasjon. Siden anvendelsen av stoffet i stor grad er begrenset til målområdet av ryggmargen, medikamenter ikke trenger å bli brukt i store doser, og enda viktigere uønskede virkninger på andre vev, slik som for en systemisk levering, kan omgås ^{1, 2.} Videre har vi kombinerer denne teknikken med in vivo transfeksjon av nukleinsyre ved hjelp av polyethylenimine (PEI) reagens ^3, noe som gir enorme allsidighet for å studere spinal funksjoner via levering av farmakologiske midler i tillegg til genet, RNA-og protein-modulatorer.

Introduction

Ryggmargen er en meget viktig senter i en rekke viktige biologiske prosesser og fysiologiske funksjoner, inkludert behandling og overføring av smertefulle (nociceptive) innganger ^4-7. Forskjellige eksperimentelle teknikker har blitt utviklet for å lette farmakologisk modulering av ryggmargen, som kronisk implantasjon av intratekal kateter ^8, ryggmargsmikroinjeksjon, og intratekal injeksjon nålen ^9.. Hver teknikk har sine egne fordeler og ulemper, og avhengig av eksperimentet paradigmet en teknikk som kan være mer egnet enn de andre. Mens kronisk implantasjon av intratekal katetre er lett gjennomførbart i rotte, er denne metoden svært vanskelig i musen, gitt størrelsesbegrensninger. Suksess er svært lav, og motoriske mangler ofte forekommer på grunn av den voluminøse nærvær av et kateter i den sterkt begrenset subdural plass i musen. Videre er langsiktig levering av legemidler gjengitt på grunn av hyppige clottingav kronisk implantert katetre. Endelig immunreaksjoner er vanlig.

Disse problemene kan omgås ved hjelp av metoden til akutt intratekal injeksjon via en kanyle i fravær av et preimplanted kateter, noe som muliggjør en rask og anatomisk begrenset anvendelse av medikamenter og reagenser til ryggmargen hos mus. Denne metoden beholder fullt ut fordelene ved intratekal over et andre systemiske leveringsveier (for eksempel oral, intravenøs, intraperitoneal, etc.) så som spesifisiteten av spinal modulasjon, noe som muliggjør reduserte doser og grense bivirkninger, så vel som evne til å levere stoffer som ikke normalt ikke krysse blod-hjerne barrieren siden under intratekal injeksjon, er nålen inn mellom dura mater og ryggmargen. Viktigere er imidlertid i forhold til andre metoder for intratekal levering, er det intratekal nål injeksjon metode den minst invasive, slik at en rekke bruksområder i densamme dyr uten å forårsake noen betydelig skade vev eller fremkaller immunreaksjon som følge av implantasjonen av fremmed materiale. Men, det krever tekniske ferdigheter for en svært presis målretting av nålen for å tillate effekt.

Her, vi visuelt demonstrere metoden for å oppnå en optimal hastighet på suksess for spesielt rettet mot ryggmargen. Injeksjonsstedet som er valgt i dette forsøk er i sporet mellom L5-og L6 vertebrate kolonne, i nærheten av der ryggmargen ender, for å minimalisere muligheten for skade på ryggraden. Videre, vi demonstrere bruken av denne teknikken til å slå ned gener i ryggmargen ved hjelp sirnas.

Protocol

Alle dyre bruk prosedyrer var i samsvar med etiske retningslinjer fastsatt av lokale styrende organ (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Tyskland). En. Utarbeidelse av siRNA / PEI Complex SiRNA / PEI kompleks løsning er utarbeidet etter produsentens anvisninger som følger: Løsning A: Fortynn den ønskede mengden av siRNA med sterilt vann (om nødvendig) inntil en fjerdedel av volumet og fortynnes ytterligere med 10% glukoseoppløsning opp …

Representative Results

For å illustrere en vellykket injeksjon, utførte vi denne teknikken bruker Fast Grønn FCF fargestoff i voksen C57Bl6 mus (8-10 ukers alder). Dyret fikk komme seg i noen minutter etter injeksjonen for å gi nok tid til at fargestoffet til å spre seg og så drept med en overdose av CO2. Deretter ble virveldyr kolonne dissekert og ryggmargen ble utsatt. Det blå puncta svarende til diffust fargestoff, som er merket på injeksjonsstedet. Ingen tegn til skade på ryggmargen kan bli sett, bekrefter minimal inva…

Discussion

Således er den ovenfor beskrevne teknikk for intratekale injeksjoner nål effektiv, rask, spesielt-lokalisert, og ikke-destruktiv. Teknisk sett er det mest kritiske aspekt ved denne fremgangsmåten punktet for nålestikk i sporet. Det er avgjørende at denne prosedyren er gjort med svært rolige hender og tålmodighet. I likhet med mange kirurgiske prosedyrer, forbedrer trening frekvensen av vellykket injeksjon. Dette er også viktig fordi under en faktisk forsøk, denne teknikk ikke gi en klar indikator for å bekreft…

Materials

in vivo-jetPEI	Polyplus	201-10G
WAVE1 siRNA	Santa Cruz	sc-36832
Control siRNA-A	Santa Cruz	sc-37007
Anti-ß-Tubulin III antibody	Sigma	T2200
Anti-WAVE1 antibody	R&D Systems	AF5514
Fast green dye	Sigma	F-7252
Isoflurane	Baxter
Isoflurane setup	Dräger Lübeck
Shaver	Wella
Hamilton syringe Gastight 1702	Hamilton
30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle	BD Microlance	304000
Microscope Leica MS5	Leica
WAVE1 forward primer for qRT-PCR	Sigma		cacagagcctcaggacagg
WAVE1 reversed primer for qRT-PCR	Sigma		cttttcaccaacggcatctt
FastStart Essential DNA Green Master	Roche	6402712001