In Vivo siRNA transfektion och Gene Knockdown i ryggmärgs via Rapid Noninvasive Lumbar Intratekal injektion i möss
Summary
Denna rapport beskriver en enkel och snabb teknik för intratekal nålstick för en lokaliserad transfektion av siRNA i ländryggen ryggmärgen i mus under kortvariga ljus anestesi.
Abstract
Denna rapport beskriver en steg-för-steg guide till tekniken med akut intratekal nål injektioner på en icke-invasiv sätt, det vill säga oberoende av kateter implantation. Den tekniska begränsning av denna kirurgiska teknik ligger i det finess av händerna. Injektionen är snabb, särskilt för en utbildad försöksledaren, och eftersom störningar vävnad med denna teknik är minimal, upprepade injektioner är möjliga och dessutom immunreaktion till utländska verktyg (. T.ex. kateter) förekommer inte, och därmed ge en bättre och mer specifik läsa ut av ryggmärgen modulation. Eftersom tillämpningen av ämnet är till stor del begränsat till målområdet i ryggmärgen, inte droger behöver inte tillämpas i stora doser, och ännu viktigare oönskade effekter på annan vävnad, som observerats med en systemisk leverans, skulle kunna kringgås 1, 2. Dessutom kombinerar vi denna teknik med in vivo-transfektion av nukleinsyra med hjälp av polyethylenimine (PEI)-reagens 3, vilket ger en enorm mångsidighet för att studera spinal funktioner via tillförsel av farmakologiska medel samt genen, RNA, och protein-modulatorer.
Introduction
Ryggmärgen är ett mycket viktigt centrum i en rad viktiga biologiska processer och fysiologiska funktioner, inklusive bearbetning och överföring av smärtsamma (nociceptiva) ingångarna 4-7. Olika experimentella tekniker har utvecklats för att underlätta farmakologisk modulering av ryggmärgen, såsom kronisk implantation av intratekala katetrar 8, ryggmärgsmikroinjektion, och intratekal nål injektion 9. Varje teknik har sina fördelar och nackdelar, och beroende på experimentet paradigm en teknik kan vara lämpligare än de andra. Skäl kronisk implantation av intratekala katetrar är lätt genomförbart i råtta, är denna metod mycket svår i mus, med tanke på storleksbegränsningar. Framgång är mycket låg och motoriken uppstår ofta på grund av den skrymmande närvaron av en kateter i strängt begränsad subdural space i mus. Dessutom är långsiktig leverans av läkemedel återges på grund av frekventa koaguleringav kroniskt implanterade katetrar. Slutligen immunreaktioner är vanliga.
Dessa problem kan kringgås genom att använda metoden för akut intratekal injektion via en nål i frånvaro av en preimplanted kateter, vilket möjliggör en snabb och anatomiskt begränsad applicering av läkemedel och reagenser i ryggmärgen hos möss. Denna metod behåller full fördel av intratekal leverans över andra systemleveransvägar (t ex oral, intravenös, intraperitoneal, etc.) såsom specificiteten för ryggradsmodulering, vilket medger reducerade doseringar och gräns biverkningar, liksom förmåga att leverera ämnena inte normalt inte passerar blod-hjärnbarriären eftersom under intratekal injektion är nålen införd mellan dura mäter och ryggmärgen. Viktigt är emellertid i jämförelse med andra metoder för intratekal leverans, är den minst invasiva det intratekala nålen injektionsmetoden, vilket möjliggör ett stort antal tillämpningar inomsamma djur utan att orsaka någon betydande vävnadsskada eller framkallar immunreaktion på grund av implantation av främmande material. Det kräver dock teknisk kompetens för en mycket exakt inriktning av nålen för att möjliggöra effektivitet.
Här, visuellt visar vi metoden för att uppnå en optimal hastighet av framgång för specifikt riktar ländryggen ryggmärgen. Injektionsstället som väljs i detta experiment är spåret mellan L5 och L6 vertebrat kolonn, nära till där ryggmärgen upphör, för att minimera risken för skador på ryggraden. Dessutom visar vi att använda denna teknik för att slå ner gener i ryggmärgen med hjälp av siRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sålunda är den ovan beskrivna tekniken med intratekala nål injektioner effektiv, snabb, specifikt lokaliserad och icke-förstörande. Tekniskt sett är den mest kritiska aspekten av detta förfarande den punkt Nålens insättning i spåret. Det är viktigt att denna procedur sker med mycket lugna händer och tålamod. Liksom många kirurgiska ingrepp, utbildning förbättrar hastigheten för lyckad injektion. Detta är också viktigt eftersom det under en verklig experiment, denna teknik inte ger en tydlig indikator …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
References
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. Neurosciences. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
