Ischemia / reperfusion में के लिए एक अनॉक्सिता भुखमरी मॉडल<em> सी. एलिगेंस</em
Summary
एक प्रोटोकॉल सी. में अनॉक्सिता / भुखमरी का उपयोग करता है वर्णन किया गया है ischemia / reperfusion मॉडल पर एलिगेंस. कार्यात्मक परिणामों वृद्धि की मृत्यु, GFP लेबल neuronal प्रक्रियाओं में दिखाई असामान्यताएं, और neuronal समारोह की आवश्यकता है कि भ्रष्ट व्यवहार प्रतिक्रियाओं शामिल हैं.
Abstract
आनुवंशिक मॉडल जीव सी एलिगेंस में अनॉक्सिता / भुखमरी के लिए प्रोटोकॉल ischemia / reperfusion अनुकरण. कीड़े जीवाणु भोजन से अलग और अनॉक्सिता के अंतर्गत रखा 20 घंटा (नकली ischemia) के लिए, और बाद में भोजन (नकली reperfusion) के साथ एक सामान्य वातावरण में स्थानांतरित कर रहे हैं. वृद्धि हुई मौत और neuronal नुकसान, और तकनीकों में इस प्रयोगात्मक प्रतिमान परिणाम जीव व्यवहार्यता, स्पर्श न्यूरॉन प्रक्रियाओं की आकृति विज्ञान के लिए परिवर्तन, साथ ही neuronal समारोह के व्यवहार उत्पादन का प्रतिनिधित्व करता है जो स्पर्श संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. अंत में, आम रसोई भंडारण कंटेनरों का उपयोग कर hypoxic इन्क्यूबेटरों के निर्माण के लिए एक विधि का वर्णन किया है. परिवर्तन कस्टम इन्क्यूबेटरों में गैस का मिश्रण करने के लिए किए जाने की, और एक परिसंचारी पानी स्नान दोनों तापमान नियंत्रण के लिए अनुमति देता है और यह आसान लीक की पहचान करने के लिए बनाता है के लिए एक जन प्रवाह नियंत्रण इकाई के अलावा की अनुमति देता है. इस विधि व्यावसायिक रूप से करने के लिए एक कम लागत विकल्प प्रदान करता हैउपलब्ध इकाइयों.
Introduction
एलिगेंस व्यापक रूप ब्रेनर 1 से इसकी शुरूआत के बाद से एक बहुकोशिकीय यूकेरियोटिक मॉडल जीव के रूप में अपनाया गया है कि एक निमेटोड है. यह आनुवंशिक परिवर्तन और प्ररूपी के बीच आसान लिंक 2 परिवर्तन की अनुमति देता है जो एक सस्ता, सरल, और बहुमुखी मॉडल, है.
Ischemia प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में से एक फट 3 उत्पादन किया है और क्षति के अधिकांश होता है जब reperfusion द्वारा पीछा पोषक तत्वों और एक ऊतक को ऑक्सीजन की आपूर्ति की कमी, के द्वारा होती है. 2002 में, सी. में ischemia / reperfusion (आईआर) की एक मॉडल एलिगेंस सामान्य परिस्थितियों में 24 घंटे के द्वारा पीछा लगभग 20 घंटे के लिए अनॉक्सिता, पोषक अभाव और गर्मी तनाव को पूरे कीड़ा प्रस्तुत करने से जुड़े 4 विकसित किया गया था. इस मॉडल को तकनीकी रूप से एक अनॉक्सिता भुखमरी (एएस) है हालांकि हालत, कोशिका मृत्यु reperfusion के दौरान oxidants द्वारा प्रेरित क्षति सहित स्तनधारियों में संरक्षित कर रहे हैं कि तंत्र के माध्यम से होता <समर्थन> 5. के रूप में सी में से प्रेरित इसके अलावा, स्तनधारी आईआर के लिए इसी तरह, नुकसान एलिगेंस इस्कीमिक शर्त 6,7 या संवेदनाहारी शर्त 8,9 से रोका जा सकता है.
नीचे प्रोटोकॉल सी. में आईआर की नकल करने के लिए प्रदर्शन एलिगेंस रूप से होने वाली रूपात्मक और व्यवहार असामान्यताएं स्कोर करने के लिए कैसे, के रूप में मॉडल का उपयोग कर, और कैसे प्रयोग एक कस्टम बनाया, आसानी से निर्माण चैम्बर विकल्प का उपयोग कर एक कम प्रारंभिक निवेश के साथ आयोजित करने की अनुमति देता है कि एक तरह से प्रोटोकॉल अनुकूलन करने के लिए .
Protocol
Representative Results
Discussion
व्यापक रूप से सी. में इस्तेमाल किया गया है आईआर चोट मॉडल को एलिगेंस. कुछ प्रमुख बिंदु इस प्रोटोकॉल के लिए प्रकाश डाला जाना चाहिए: एलिगेंस इस प्रणाली का उपयोग कर मौत को प्राप्त करने के लिए 3 सहवर्ती अपमान (गर्मी, भुखमरी और अनॉक्सिता) के लिए की जरूरत को न्यायोचित ठहरा, चोटों की एक विस्तृत सरणी के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. अकेले अनॉक्सिता समय 14 की इस विंडो में कीड़े मार नहीं है. इसके अलावा, तापमान में वृद्धि एक अतिरिक्त तनाव है, तो यह बारीकी से नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है. सच पूछिये तो, भुखमरी से प्रति, 7 मनाया मृत्यु दर की डिग्री करने के लिए काफी योगदान नहीं है, लेकिन यह प्रयोगात्मक प्रतिकृति के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रकट होता है. दिन के लिए दिन से महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता हो सकता है कि यह देखते हुए, यह नमूने समानांतर में सीधे चला तुलना करने के लिए, और कई दिनों से अधिक प्रयोगों को दोहराने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. सामान्य में, परिणामों 50-100 कीड़े के तीन अलग प्लेटों / प्रयोगात्मक हालत के लिए मापा और इन कर रहे हैंn औसत और एक भी प्रयोगात्मक दोहराने के रूप में माना जाता है. आम तौर पर, सात और नौ के बीच प्रतिकृति को प्राप्त करने या सांख्यिकीय महत्व से इनकार करने के लिए पर्याप्त होना दिखाई देते हैं.
प्रयोग में इस्तेमाल कीड़े की विकास मंच भी क्षति काफी 15,16 भिन्न होता है के रूप में ध्यान करने के लिए विभिन्न चरणों की संवेदनशीलता के रूप में नजर रखी जा करने की जरूरत है. युवा वयस्कों के उपयोग के मानक है, और लार्वा चरण (L3 और L4) कीड़े के रूप में (अप्रकाशित डेटा) के हानिकारक प्रभावों के लिए प्रतिरोधी हो दिखाई देते हैं.
इस प्रोटोकॉल प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए दो तरीके हैं, एक वाणिज्यिक hypoxic कक्ष 4,6 का उपयोग और अन्य (Tupperware प्रकार के कंटेनर और गैस इनपुट 11 का प्रयोग करके) एक प्रयोगशाला में किए गए उपकरण का उपयोग कर एक प्रस्तुत करता है. कहीं 13,17 वर्णित के रूप में अनॉक्सिता, ऑक्सीजन की खपत है कि अन्य तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है. एक hypoxic माहौल बनाने के लिए वैकल्पिक तकनीक का उपयोग आवश्यक के रूप में ऊष्मायन समय बदल सकते हैंमौत के वांछित राशि बनाने के लिए. 80% के रूप में के हानिकारक प्रभाव को बढ़ा कि हस्तक्षेप के लिए इसी प्रकार आदर्श है, जबकि ~ 20% अस्तित्व का लक्ष्य निर्धारण, सुरक्षात्मक उपायों के अध्ययन के लिए एक आदर्श आरंभ बिंदु है. एक अन्य महत्वपूर्ण चेतावनी जिस पर पर्यवेक्षक के स्कोर जीवित / मृत कीड़े समय है. विश्लेषण के लिए समय 24 घंटा आगे बढ़ाया जाता है तो मृत कीड़े की पहचान करने के लिए तेजी से मुश्किल हो, के बाद से डेटा को गुमराह किया जा सकता है. इस वजह से कीड़ा शवों समय के साथ अपेक्षाकृत पारदर्शी बनने के लिए हो सकता है, लेकिन यह भी निषेचित भ्रूण शवों के अंदर संतान पोस्टमार्टम में विकसित और वे उभरने के रूप में उन्हें बाधित कर सकते हैं तथ्य यह है कि हो सकता है.
neuronal आकारिकी का विश्लेषण प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न 18, नाभिकीय विखंडन 4 और उचित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग मार्कर व्यक्त करता है कि एक कीड़ा तनाव प्रतिस्थापन से अन्य मापदंडों 19 को देखने के लिए संशोधित किया जा सकता है. एक अंतिम चेतावनी है कि के दृश्यneuronal प्रक्रियाओं स्लाइड पर कीड़े रखने के बाद कम से कम 30 मिनट किया जाना चाहिए. अब समय के रूप में स्वतंत्र क्षति प्रदर्शन कर सकते हैं के लिए पशु स्लाइड पर संज्ञाहरण के तहत रखा. उन्हें ट्रैक और विश्लेषण की जरूरत समय के अनुसार स्लाइड प्रति जानवरों की राशि को समायोजित करें.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
आंकड़े 1 और 2 में पहले फ्री रेडिकल बायोलॉजी एंड मेडिसिन (Queliconi एट अल. 5) में प्रकाशित और Elsevier द्वारा आयोजित कॉपीराइट रहे थे. इस काम के द्वारा समर्थित किया गया Fundação डे Amparo à Pesquisa एस्टाडो डी साओ पाउलो (FAPESP), Instituto Nacional डी Ciencia ई Tecnologia डे Processos रिडॉक्स उन्हें Biomedicina, Pesquisa डे Processos रिडॉक्स उन्हें Biomedicina, USPHS NS064945 (कर्नाटक) एक Nucleo डे Apoio, और USPHS GM087483 (के.एन. करना ). BBQ एक FAPESP फैलोशिप द्वारा समर्थित एक डॉक्टरेट की छात्रा है.
Materials
| N2 strain | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | Wild type strain | |
| TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | TU2583 | integrated fluorescent transgene used to label touch neurons |
| CB1338 mec-3 (e1338)IV | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | CB1338 | canonical mec-3 mutant that is touch insensitive |
| Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U Microscope | Nikon USA | TE2000-U | |
| Low Temperature Incubator | Sheldon Manufacturing Inc. | Model 2005 | |
| Eyelash Pick | An eyelash pick can be prepared by attaching an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3) | ||
| Hypoxic Chamber | Coy | 8307030 | Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller. |
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