التصوير من خلال حالة العذراء من<em> ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em
Summary
يوضح هذه الورقة استخدام المجهر متحد البؤر المسح السريع إلى سلوك الخلية صورة مباشرة من خلال puparium. من خلال ترك حالة العذراء سليمة، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة وقياس العمليات الحيوية في الخلية مرحلة من مراحل التنمية ذبابة الفاكهة التي يصعب دراسة مباشرة.
Abstract
استخدام منذ فترة طويلة من ذبابة الفاكهة نموذجا لخلية والبيولوجيا التطورية قد حقق مجموعة من الأدوات. معا، وقد مكنت هذه التقنيات تحليل الخلية والبيولوجيا التطورية من مجموعة متنوعة من الزوايا المنهجية. التصوير الحي هو أسلوب الناشئة لمراقبة عمليات الخلية الحيوية، مثل انقسام الخلية أو الخلايا المنوية على الحركة. بعد أن الطفرات معزولة في uncharacterized المفترضة البروتينات دورة الخلية أصبح من الضروري أن نلاحظ الانقسام في الموقع باستخدام التصوير الحي. وقد ركزت معظم الدراسات التصوير الحي في ذبابة الفاكهة على المراحل الجنينية التي يمكن الوصول إليها للتلاعب والمراقبة بسبب صغر حجمها وضوح بصري. ومع ذلك، في هذه المراحل دورة الخلية غير عادي من حيث أنه يفتقر إلى واحدة من مراحل الفجوة أو كليهما. على النقيض من ذلك، خلايا الجناح العذراء ذبابة الفاكهة لديها دورة الخلية النموذجية والخضوع لفترة من الانقسام السريع الذي يمتد حوالي 20 ساعة للتنمية العذراء. فمن السهل أن طdentify وعزل الشرانق من المرحلة المناسبة للقبض على الانقسام في الموقع. قدمت تصاعد الشرانق سليمة أفضل مزيج من معرفة منشأ والمتانة أثناء التصوير، مما يسمح للتجارب لتشغيل لعدة ساعات مع تأثير ضئيل على الخلايا الحيوانية وقدرتها على البقاء. الأسلوب يسمح للمراقبة من الميزات صغيرة مثل، أو أصغر من، ويطير الكروموسومات. تعديل إعدادات المجهر وتفاصيل تصاعد مستمر، ويسمح بتمديد إعداد تصور ديناميات غشاء الخلايا المجاورة والبروتينات fluorescently المسمى مثل تويولين. يعمل هذا الأسلوب لجميع البروتينات الفلورية اختبارها ويمكن التقاط ملامح نطاق submicron على مجموعة متنوعة من النطاقات الزمنية. بينما تقتصر على 20 ميكرومتر الخارجي للخادرة مع المجهر متحد البؤر التقليدية، قد يكون هذا النهج لمراقبة البروتين وديناميات الخلوية في أنسجة العذراء في الجسم الحي مفيدة عموما في دراسة الخلية والبيولوجيا التطورية في هذه الأنسجة.
Introduction
ذبابة الخل، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، هو نموذج راسخة لدراسة جوانب كثيرة من علم الأحياء. البحوث ذبابة الفاكهة لديها تاريخ غني من التجارب الجينية التي تسمح أشكال متطورة من التلاعب الجيني بما في ذلك التعبير، ضربة قاضية والطفرة. مع ظهور علامات بروتين فلوري، وسعت هذه الدراسات لتشمل ذخيرة من الخلايا والبروتينات في الحيوانات الحية. الجنين ذبابة هو نظام ممتاز لمثل هذه الدراسات كما هو واضح بصريا الصغيرة والسماح العميق، وارتفاع القرار التصوير في الجسم الحي 1-3. وقد أثبتت المراحل الأخرى للتنمية ذبابة إلى أن تكون أقل لين العريكة، والتي تتطلب تخدير 4، تشريح والثقافة على المدى القصير 5،6، أو إنشاء النوافذ في إهاب للتصوير 7،8. هذه المناورات عادة تنازلات التنمية الحيوانية على المدى الطويل أو تؤثر على الحيوانات في الطرق التي تحد من التصوير لفترات قصيرة.
الأنف والحنجرة "> دراسة الطفرات في الجينات الرواية التي تشبه المنظمين دورة الخلية، كان من الضروري العثور على إعداد المناسب لدراسة توقيت والإخلاص من دورة الخلية. منذ يتم اقتطاع معظم دورات الخلايا الجنينية (SM أو S-G2-M) والمسوخ قيد الدراسة لا تظهر العيوب حتى مراحل لاحقة، كان من المهم أن نلاحظ دورة الخلية في الأنسجة مرحلة العذراء. الخلايا الظهارية في خادرة لها دورة الخلية G1-S-G2-M أكثر نموذجية والشرانق من هذه المرحلة هي غير قادرة على حركات العضلات 9. تضمنت نقطة الانطلاق الأولي للتلاعب الشرانق كلها سليمة معربا عن Histone2AV-GFP. وعلى الرغم من التعتيم على ما يبدو من حالة العذراء، وثبت هذا التحضير سليمة لتكون ممتازة على المدى الطويل في مجال التصوير الجسم الحي. هذه التقنية بسيطة يكفي أن الباحثين الجامعيين بشكل روتيني استخدامها لدراسة جوانب الخلية والبيولوجيا التطورية في ذبابة الفاكهة وبعد هذا القرار على ما يرام بما يكفي للسماح التمييز من الميزات مقياس ميكرومتر. مع هذا الأسلوب، والملاحظات من الأحداث على مدى الساعات والدقائق أو الثواني من الممكن ببساطة من خلال تعديل معايير السلاسل الزمنية. أشرطة الفيديو باستخدام الأزرق والأخضر والأصفر والبرتقالي، والأحمر البروتينات الفلورية، أو مزيج من هذه، بذلت. الأهم من ذلك، إذا أخذ الرعاية للحد من كثافة الليزر، حتى التصوير على المدى الطويل ليس له تأثير على التنمية أو بقاء الحيوانات.Protocol
Representative Results
Discussion
لتصور، وقياس، وتحديد ملامح تقسيم الخلايا، والتنمية المطلوبة لإعداد بسيطة لمراقبة الانقسام في الجناح العذراء تعيش ذبابة الفاكهة عن طريق تحليل متحد البؤر من His2AvGFP معربا عن الخلايا. وقد استخدم هذا الأسلوب لتوثيق أن دورة الخلية في الجناح العذراء تحمل أوجه التشابه …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نود أن نعترف أكيرا تشيبا للحصول على الدعم الفكري والدعم المادي، والمخزونات. بفضل جوليا Dallman للتعليق عليه.
Materials
| Fly stuff fly pad | Genesee scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas south | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas south | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine science tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular and subcellular features | |
| Immersion oil (non fluorescent) | |||
| Stereo microscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly’s perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
