Imaging Door de Pupal zaak van<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.
Abstract
Het langdurig gebruik van Drosophila als model voor cel-en ontwikkelingsbiologie heeft een scala aan instrumenten opgeleverd. Samen hebben deze technieken analyse van cel en ontwikkelingsbiologie vanuit verschillende methodologische invalshoeken mogelijk. Live-Imaging is een nieuwe methode voor het observeren van dynamische cellulaire processen zoals celdeling en cel beweeglijkheid. Na geïsoleerd mutaties in ongekarakteriseerde vermeende celcycluseiwitten werd het essentieel om mitose observeren in situ met behulp van live beeldvorming. De meeste levende imaging studies in Drosophila hebben geconcentreerd op de embryonale stadia die toegankelijk is voor manipulatie en observatie zijn vanwege hun kleine formaat en optische helderheid. In deze fasen de celcyclus ongebruikelijk, dat geen een van de spleet fasen of beide. Daarentegen cellen van het popstadium vleugel van Drosophila hebben een typische celcyclus ondergaan een periode van snelle mitose uitstrekt over ongeveer 20 hr popstadium ontwikkeling. Het is gemakkelijk om identify en isoleren poppen van de juiste fase om mitose te vangen in situ. Montage intact poppen voorwaarde dat de beste combinatie van volgzaamheid en duurzaamheid tijdens de beeldvorming, waardoor experimenten uit te voeren voor een aantal uren met een minimale impact op de cel en dierlijke levensvatbaarheid. De methode maakt observatie van functies zo klein als of kleiner dan, vliegen chromosomen. Aanpassing microscoop instellingen en de bevestiging, toegestane verlenging van het preparaat membraan dynamica van aangrenzende cellen en fluorescent gelabelde eiwitten zoals tubuline visualiseren. Deze methode werkt voor alle geteste fluorescerende eiwitten en kan submicron schaal functies over een verscheidenheid van tijdschalen vangen. Terwijl beperkt tot de buitenste 20 urn van de pop met een conventionele confocale microscoop kan deze benadering observeren eiwitten en cellulaire dynamiek pupal weefsels in vivo algemeen bruikbaar in de studie van cel en ontwikkelingsbiologie in deze weefsels.
Introduction
De azijn Drosophila melanogaster, is een goed uitgewerkt model voor het bestuderen van vele aspecten van de biologie. Drosophila onderzoek heeft een rijke geschiedenis van genetische experimenten die verfijnde vormen van genetische manipulatie, waaronder expressie, knock-down en mutatie maakt. Met de komst van fluorescente proteïne labels, heeft dit repertoire uitgebreid onderzoek van cellen en eiwitten omvatten in levende dieren. De vlieg embryo is een uitstekend systeem voor dergelijke studies zoals het is klein en optisch helder waardoor diepe, hoge-resolutie imaging in vivo 1-3. Andere stadia van vliegen ontwikkeling hebben bewezen minder handelbaar te zijn, die voor pijn 4, dissectie en korte termijn cultuur 5,6, of de creatie van de ramen in de cuticula voor de beeldvorming 7,8. Deze manipulaties meestal compromis dierlijke ontwikkeling op lange termijn, noch de dieren op een manier die beeldvorming beperken tot korte perioden.
ent "> Om nieuwe mutaties te bestuderen in genen die de celcyclus regulatoren lijken, was het essentieel om een passende voorbereiding op de timing en de trouw van de celcyclus te bestuderen vinden. Aangezien de meeste embryonale cel cycli worden afgekapt (SM of S-G2-M) en mutanten onderzochte geen afwijkingen vertonen pas later stadium, was het belangrijk om de celcyclus in acht popstadium weefsels. epitheelcellen in de pop een meer typische G1-S-G2-M celcyclus en poppen van deze fase zijn niet in staat spierbewegingen 9 De eerste uitgangspunt manipulaties opgenomen intacte hele poppen expressie Histone2AV-GFP. Ondanks de schijnbare dichtheid van het popstadium. Deze intacte preparaat bleek uitstekende lange termijn in vivo beeldvorming zijn. Deze techniek is eenvoudig genoeg dat undergraduate onderzoekers gebruiken routinematig om aspecten van cel-en ontwikkelingsbiologie in Drosophila studeren en toch de resolutie is fijn genoeg om discriminatie van micrometer schaal functies kunt. Met deze methode, observaties van gebeurtenissen dan uren, minuten of seconden zijn mogelijk gewoon door het aanpassen van tijdreeksen parameters. Video behulp van blauw, groen, geel, oranje en rood fluorescerende eiwitten, of combinaties daarvan, zijn gemaakt. Belangrijk is wanneer getracht het laserintensiteit minimaliseren, zelfs op lange termijn beeldvorming heeft geen effect op de ontwikkeling of de levensvatbaarheid van de dieren.Protocol
Representative Results
Discussion
Visualiseren, meten en kwantificeren kenmerken van delende cellen, vereist de ontwikkeling van een eenvoudige voorbereiding voor het observeren van mitose in de levende pupal vleugel van Drosophila door middel van confocale analyse van His2AvGFP expressie cellen. Deze methode werd gebruikt om te documenteren dat de celcyclus in het popstadium vleugel draagt sterke gelijkenissen met cycli cel in pseudostratified epitheel in die kernen verhuizing naar de apicale oppervlak van het epitheel waar ze mitose voe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Akira Chiba erkennen voor intellectuele steun, materiële steun, en de voorraden. Met dank aan Julia Dallman voor commentaar.
Materials
| Fly stuff fly pad | Genesee scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas south | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas south | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine science tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular and subcellular features | |
| Immersion oil (non fluorescent) | |||
| Stereo microscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly’s perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
