הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em> Melanogaster דרוזופילה</em
Summary
מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.
Abstract
השימוש ארוך השנים של דרוזופילה כמודל לתא וביולוגיה התפתחותית הניב מערך של כלים. יחד, בטכניקות אלה אפשרו ניתוח של תא וביולוגיה התפתחותית ממגוון רחב של זוויות מתודולוגי. הדמיה חיה היא שיטה המתעוררות להתבוננות בתהליכי תא דינמיים, כגון חלוקת תא או תנועתיות תא. לאחר שבודד מוטציות בחלבוני מחזור תא המשוערת uncharacterized זה הפך חיוני להתבונן מיטוזה באתרם באמצעות הדמיה לחיות. רוב מחקרי הדמיה לחיות בדרוזופילה התמקדו בשלבים העובריים, כי הם נגישים למניפולציה ותצפית בגלל הגודל הקטן שלהם והבהירות אופטית. עם זאת, בשלבים אלה את מחזור התא הוא יוצא דופן בכך שהוא חסר אחד או שני שלבי הפער. לעומת זאת, יש תאים של אגף גלמים של דרוזופילה מחזור תא טיפוסי ועוברים תקופה של מיטוזה המהירה פורש על 20 שעות של פיתוח גלמים. זה קל ליdentify ולבודד גלמים של השלב המתאים לתפוס מיטוזה באתרם. גלמים ללא פגע הרכבה סיפקו את השילוב הטוב ביותר של עקיבות ועמידות במהלך הדמיה, המאפשרים ניסויים לרוץ במשך כמה שעות עם השפעה מינימאלית על כדאיות תא ושל בעלי חיים. השיטה מאפשרת התבוננות בתכונות קטנה כמו, או קטן יותר, לעוף כרומוזומים. התאמה של הגדרות מיקרוסקופ ואת הפרטים של הרכבה, אפשרה הרחבה של ההכנה כדי להמחיש דינמיקת קרום של תאים סמוכים וחלבונים שכותרתו fluorescently כגון טובולין. שיטה זו עובדת עבור כל חלבוני הניאון נבדקו ויכולה ללכוד תכונות submicron סולם על מגוון רחב של סולמות זמן. אמנם מוגבל ל -20 מיקרומטר החיצוני של הגולם עם מיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, גישה זו להתבוננות חלבון ודינמיקה הסלולר ברקמות גלמי in vivo יכולה להיות, בדרך כלל שימושית בחקר התא וביולוגיה התפתחותית ברקמות אלה.
Introduction
זבוב החומץ, דרוזופילה melanogaster, הוא מודל מבוסס היטב ללימוד היבטים רבים של ביולוגיה. יש מחקר דרוזופילה היסטוריה עשירה של ניסויים גנטיים המאפשרת לצורות מתוחכמות של מניפולציה גנטית, כולל ביטוי, מציאה ומוטציה. עם כניסתו של תוויות חלבון פלואורסצנטי, הרפרטואר הזה התרחב והוא כולל מחקרים של תאים וחלבונים חי חיות. עובר הזבוב הוא מערכת מצוינת למחקרים כגון זה הוא קטן וברור אופטי המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה עמוקה, in vivo 1-3. שלבים אחרים של התפתחות זבוב הוכיחו להיות פחות צייתן, הדורשים הרדמה 4, לנתיחה ותרבות לטווח קצר 5,6, או יצירה של חלונות בציפורן הדמיה 7,8. מניפולציות אלה בדרך כלל לפגוע בהתפתחות בעלי חיים בטווח הארוך או להשפיע על בעלי החיים בדרכים המגבילות את ההדמיה לתקופות קצרות.
אף אוזן גרון "> כדי לחקור מוטציות רומן בגנים שדומים רגולטורים מחזור תא, זה היה חיוני למצוא היערכות מתאימה כדי ללמוד את התזמון ונאמנות של מחזור התא. מאחר שרוב מחזורי תא העובריים מעוגלים (SM או S-G2-M) והמוטציות תחת מחקר לא מראות פגמים עד שלבים מאוחר יותר, זה היה חשוב לקיים את מחזור התא ברקמות שלב גלמים. תאי אפיתל בגולם יש מחזור טיפוסי יותר G1-S-G2-M תא וגלמים של שלב זה הם לא מסוגלים תנועות שרירים 9. נקודת ההתחלה הראשונית למניפולציות כללה כל גלמים שלמים להביע Histone2AV-GFP. למרות האטימות, לכאורה, של המקרה גלמי, הכנה ללא פגע זה הוכיחה את עצמו מצוין לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo. טכניקה זו היא פשוטה די בכך שהחוקרים לתואר ראשון באופן שיגרתי להשתמש בו כדי ללמוד היבטים של תא וביולוגיה התפתחותית בדרוזופילה ועדיין הרזולוציה היא בסדר מספיק כדי לאפשר אפליה של תכונות בקנה מידה מיקרומטר. בשיטה זו, תצפיות של אירועים על פני שעות, דקות או שניות הן אפשריות רק על ידי התאמת פרמטרים סדרת הזמן. וידאו באמצעות חלבונים כחולים, ירוקים, צהובים, כתום, אדומים וניאון, או שילוב של אלה, נעשה. חשוב מכך, אם טיפול שננקט כדי למזער את עוצמת הלייזר, יש אפילו הדמיה לטווח ארוך אין כל השפעה על התפתחות או כדאיות של בעלי החיים.Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להמחיש, למדוד, ולכמת את תכונות של תאים מתחלקים, פיתוח הנדרש של הכנה פשוטה להתבוננות מיטוזה באגף גלמים החי של דרוזופילה באמצעות ניתוח confocal של His2AvGFP לבטא בתאים. שיטה זו שימשה לתיעוד שמחזור התא באגף גלמים מתאפיין בקווי דמיון חזקים לתא מחזורים בepithelia pseudostratified שבמ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות אקירה צ'יבה לתמיכה רוחני, תמיכה חומרית, ומניות. הודות לג'וליה Dallman להערות.
Materials
| Fly stuff fly pad | Genesee scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas south | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas south | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine science tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular and subcellular features | |
| Immersion oil (non fluorescent) | |||
| Stereo microscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly’s perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
