की पोटा संबंधी मामले के माध्यम से इमेजिंग<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
Summary
इस पत्र सीधे puparium के माध्यम से छवि सेल व्यवहार करने के लिए एक तेजी से स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग दर्शाता है. बरकरार पोटा संबंधी मामले छोड़ने करके, इस विधि सीधे अध्ययन करने के लिए मुश्किल है कि ड्रोसोफिला विकास के एक चरण में अवलोकन और गतिशील सेल प्रक्रियाओं की माप की अनुमति देता है.
Abstract
सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के लिए एक मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला की लम्बे समय से उपयोग उपकरणों की एक सरणी प्राप्त हुए है. साथ में, इन तकनीकों पद्धति कोण की एक किस्म से सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के विश्लेषण के लिए सक्षम है. लाइव इमेजिंग ऐसी कोशिका विभाजन या सेल गतिशीलता के रूप में गतिशील सेल प्रक्रियाओं, के अवलोकन के लिए एक उभरते विधि है. यह लाइव इमेजिंग का उपयोग बगल में पिंजरे का बँटवारा निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हो गया uncharacterized ख्यात सेल चक्र प्रोटीन में उत्परिवर्तन पृथक करने के बाद. ड्रोसोफिला में सबसे रहते इमेजिंग अध्ययन क्योंकि उनके छोटे आकार और ऑप्टिकल स्पष्टता के हेरफेर और अवलोकन करने के लिए पहुंच रहे हैं कि भ्रूण चरणों पर ध्यान केंद्रित किया है. यह खाई चरणों में से एक या दोनों का अभाव है में हालांकि, इन चरणों में सेल चक्र असामान्य है. इसके विपरीत, ड्रोसोफिला की पोटा संबंधी विंग की कोशिकाओं को एक ठेठ सेल चक्र है और पोटा संबंधी विकास के बारे में 20 घंटे फैले तेजी से पिंजरे का बँटवारा की अवधि से गुजरना. यह मैं करने के लिए आसान हैdentify और बगल में पिंजरे का बँटवारा पकड़ने के लिए उचित मंच की pupae अलग. बढ़ते बरकरार pupae प्रयोगों सेल और पशु व्यवहार्यता पर न्यूनतम प्रभाव के साथ कई घंटे के लिए चलाने की अनुमति, इमेजिंग दौरान शिक्षणीयता और स्थायित्व के लिए सबसे अच्छा संयोजन प्रदान की. विधि के रूप में छोटे, या की तुलना में छोटे, गुणसूत्रों मक्खी के रूप में सुविधाओं का अवलोकन की अनुमति देता है. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स और बढ़ते के विवरण का समायोजन, तैयारी का विस्तार झिल्ली सन्निकट कक्षों की गतिशीलता और ऐसे ट्यूबिलिन रूप fluorescently लेबल प्रोटीन कल्पना करने की अनुमति दी. इस विधि का परीक्षण फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए काम करता है और समय पैमाने की एक किस्म पर submicron पैमाने सुविधाओं पर कब्जा कर सकते हैं. एक पारंपरिक confocal खुर्दबीन के साथ प्यूपा के बाहरी 20 माइक्रोन तक ही सीमित है, जबकि इन विवो में पोटा संबंधी ऊतकों में प्रोटीन और सेलुलर गतिशीलता को देख के लिए इस दृष्टिकोण इन ऊतकों में सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में आम तौर पर उपयोगी हो सकता है.
Introduction
सिरका मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर,. ड्रोसोफिला अनुसंधान अभिव्यक्ति, पछाड़ना और उत्परिवर्तन सहित जीन में गड़बड़ी की परिष्कृत रूपों की अनुमति देता है कि आनुवंशिक प्रयोग का एक समृद्ध इतिहास है जीव विज्ञान के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल के आगमन के साथ, यह प्रदर्शनों की सूची रहने वाले जानवरों में कोशिकाओं और प्रोटीन का अध्ययन में शामिल करने के लिए विस्तार किया गया है. मक्खी भ्रूण यह विवो 1-3 में गहरी, उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति के लिए छोटे और ऑप्टिकली स्पष्ट है के रूप में इस तरह के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट सिस्टम है. मक्खी विकास के अन्य चरणों बेहोशी 4, विच्छेदन और अल्पावधि संस्कृति 5,6, या इमेजिंग 7,8 के लिए छल्ली में खिड़कियों के निर्माण की आवश्यकता होती है, कम विनयशील होना सिद्ध कर दिया है. इन जोड़तोड़ आमतौर पर लंबी अवधि में पशु विकास समझौता या कम समय के लिए इमेजिंग कि सीमा मायनों में पशु प्रभावित करते हैं.
सबसे भ्रूण कोशिका चक्र छोटा हैं चूंकि सेल चक्र नियामकों जैसे लगते हैं कि जीन में उपन्यास म्यूटेशन का अध्ययन करने के लिए ईएनटी ">, यह. सेल चक्र के समय और निष्ठा का अध्ययन करने के लिए एक उचित तैयारी खोजने के लिए आवश्यक था (एस या एस G2 एम) और अध्ययन के तहत म्यूटेंट बाद के चरणों तक, यह पोटा संबंधी मंच ऊतकों में कोशिका चक्र निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण था दोष नहीं दिखाते. प्यूपा में उपकला कोशिकाओं एक अधिक विशिष्ट G1-S-G2 एम सेल चक्र और इस स्तर के pupae हैं मांसपेशी आंदोलनों 9 में सक्षम नहीं. जोड़तोड़ के लिए प्रारंभिक प्रारंभिक बिंदु पोटा संबंधी मामले की स्पष्ट अस्पष्टता के बावजूद Histone2AV-GFP व्यक्त बरकरार पूरे pupae. शामिल, इस बरकरार तैयारी vivo इमेजिंग में लंबी अवधि के लिए उत्कृष्ट साबित हुई. इस तकनीक को सरल है स्नातक शोधकर्ताओं नियमित ड्रोसोफिला में सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं और अभी तक संकल्प सुक्ष्ममापी पैमाने पर सुविधाओं की भेदभाव की अनुमति के लिए पर्याप्त ठीक है कि पर्याप्त. इस विधि के साथ, घंटे, मिनट, या सेकंड से अधिक घटनाओं की टिप्पणियों बस समय श्रृंखला मापदंडों का समायोजन करके संभव हैं. नीले, हरे, पीले, नारंगी, और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, या इन के संयोजन का उपयोग वीडियो बना दिया गया है. महत्वपूर्ण बात है, अगर देखभाल भी लंबे समय तक इमेजिंग जानवरों के विकास या व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं है, लेजर तीव्रता को कम करने के लिए लिया जाता है.Protocol
Representative Results
Discussion
विभाजित कोशिकाओं की सुविधाओं, His2AvGFP कोशिकाओं व्यक्त की confocal विश्लेषण के माध्यम से ड्रोसोफिला के रहने वाले पोटा संबंधी विंग में पिंजरे का बँटवारा के अवलोकन के लिए एक सरल तैयारी के लिए जरूरी विकास, कल्प…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों बौद्धिक समर्थन, सामग्री का समर्थन, और शेयरों के लिए अकीरा चिबा स्वीकार करना चाहते हैं. टिप्पणी के लिए जूलिया Dallman करने के लिए धन्यवाद.
Materials
| Fly stuff fly pad | Genesee scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas south | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas south | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine science tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular and subcellular features | |
| Immersion oil (non fluorescent) | |||
| Stereo microscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly’s perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
