Imaging Genom pupal Fall av<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Detta dokument visar användningen av en snabb scanning konfokalmikroskop bilden cellens beteende direkt genom puparium. Om du lämnar det PUPP fall intakt, gör denna metod observation och mätning av dynamiska cellprocesser i ett skede av Drosophila utveckling som är svår att studera direkt.
Abstract
Den långvariga användning av Drosophila som en modell för cell-och utvecklingsbiologi har gett en rad verktyg. Tillsammans har dessa tekniker möjlig analys av cell-och utvecklingsbiologi från en mängd olika metodologiska vinklar. Live avbildning är en växande metod för att observation dynamiska cellprocesser, såsom celldelning eller cellrörlighet. Efter att ha isolerade mutationer i okarakteriserade förmodade cellcykelns proteiner blev det viktigt att observera mitos på plats med hjälp av live-avbildning. De flesta live-imaging studier i Drosophila har fokuserat på de embryonala stadierna som är tillgängliga för manipulation och observation på grund av sin ringa storlek och optisk klarhet. Men i dessa stadier i cellcykeln är ovanlig i det att den saknar en eller båda av de spalt faser. Däremot celler av pupal flygel Drosophila har en typisk cellcykeln och genomgå en period av snabb mitos som spänner över omkring 20 h av pupal utveckling. Det är lätt att identify och isolera puppor av respektive fas för att fånga mitos in situ. Montering intakt puppor ger den bästa kombinationen av spårbarhet och hållbarhet under avbildning, så försök att köra i flera timmar med minimal påverkan på cell-och djurlivsduglighet. Metoden medger observation av funktioner så liten som, eller mindre än, fluga kromosomer. Justering av mikroskopinställningar och detaljerna för montering, tillät förlängning av preparatet för att visualisera membran dynamiken i angränsande celler och fluorescerande proteiner såsom tubulin. Denna metod fungerar för alla testade fluorescerande proteiner och kan fånga submikrona skala funktioner över en mängd olika tidsskalor. Medan begränsad till det yttre 20 um av puppan med en konventionell konfokalmikroskop, kan denna metod för att observera protein och cellulära dynamik i PUPP vävnader in vivo vara generellt användbar i studiet av cell-och utvecklingsbiologi i dessa vävnader.
Introduction
Den vinäger fluga, Drosophila melanogaster, är en väl etablerad modell för att studera många aspekter av biologi. Drosophila forskning har en rik historia av genetiska experiment som tillåter avancerade former av genmanipulation inklusive uttryck, knockdown och mutation. Med tillkomsten av fluorescerande proteinetiketter har denna repertoar utökats med studier av celler och proteiner i levande djur. Flugan embryot är ett utmärkt system för sådana studier eftersom den är liten och optiskt klar låta djupt, högupplösande avbildning in vivo 1-3. Andra stadier fluga utveckling har visat sig vara mindre foglig, som kräver narkos 4, dissektion och kortsiktiga kultur 5,6, eller skapandet av fönster i nagelbanden för avbildning 7,8. Dessa manipulationer kompromissa oftast djur utveckling på lång sikt eller påverkar djur på ett sätt som begränsar avbildning för korta perioder.
ent "> Att studera nya mutationer i gener som liknar cellcykelregulatorer, var det viktigt att hitta en lämplig förberedelse för att studera när och trohet av cellcykeln. Eftersom de flesta embryonala cellcykler trunkeras (SM eller S-G2-M) och de mutanter som studeras inte visar fel förrän senare skeden, var det viktigt att observera cellcykeln i puppstadium vävnader. Epitelceller i puppan har en mer typisk G1-S-G2-M cellcykeln och puppor i detta skede är inte klarar av muskelrörelser 9. Den initiala utgångspunkt för manipulationer ingår intakt hela puppor uttrycker Histone2AV-GFP. Trots den uppenbara opacitet PUPP fallet denna intakt preparat visat sig vara utmärkt för långtids in vivo imaging. Tekniken är enkel nog att grund forskare rutinmässigt använda den för att studera aspekter av cell-och utvecklingsbiologi i Drosophila och ändå upplösningen är bra nog för att tillåta diskriminering på mikrometernivå funktioner. Med den här metoden, observationer av händelser under timmar, minuter eller sekunder är möjliga att helt enkelt genom att justera tidsserieparametrar. Videor med blått, grönt, gult, orange och rött fluorescerande proteiner, eller kombinationer av dessa har gjorts. Viktigt är om omsorg för att minimera laserintensiteten, även långsiktiga avbildning har ingen effekt på utvecklingen eller livskraft djuren.Protocol
Representative Results
Discussion
För att visualisera, mäta och kvantifiera egenskaper hos delande celler, krävs utveckling av en enkel förberedelse för att observera mitos i levande PUPP flygel Drosophila genom konfokal analys av His2AvGFP uttryckande celler. Denna metod användes för att dokumentera att cellcykeln i PUPP flygeln har stora likheter till cellcykler i pseudostratified epitel i att kärnor flytta till den apikala yta epitel där de går in mitos. Efter telofas, kärnor falla tillbaka in i epitelskiktet. Därför de rutor i …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna Akira Chiba för intellektuellt stöd, materiellt stöd, och lager. Tack till Julia Dallman för kommentarer.
Materials
| Fly stuff fly pad | Genesee scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas south | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas south | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine science tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular and subcellular features | |
| Immersion oil (non fluorescent) | |||
| Stereo microscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly’s perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
