Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.
Abstract
Hücre ve gelişim biyolojisi için bir model olarak Drosophila uzun süredir devam eden kullanım araçları bir dizi vermiştir. Birlikte, bu teknikler metodolojik açılardan çeşitli hücre ve gelişim biyolojisi analizini sağlamıştır. Canlı görüntüleme, hücre bölünmesi ya da hücre hareketi gibi dinamik hücre süreçlerini, gözlem için gelişmekte olan bir yöntemdir. Canlı görüntüleme kullanarak yerinde mitoz gözlemlemek için gerekli oldu uncharacterized farazi hücre döngüsü proteinleri mutasyonlar izole olması. Drosophila en canlı görüntüleme çalışmaları nedeniyle küçük boyutu ve optik netlik manipülasyon ve gözlem için erişilebilir embriyonik aşamalarında odaklanmıştır. Bu boşluk fazlarının biri ya da her ikisi yoksun olmasıyla Ancak, bu aşamada, hücre döngüsü sıra dışıdır. Buna karşılık, Drosophila pupa kanadının hücreleri, tipik bir hücre döngüsü ve pupa gelişme, yaklaşık 20 saat süren hızlı bir mitoz bir süre geçer. Bu i kolaydentify ve yerinde mitoz yakalamak için uygun sahnenin pupa izole. Montaj sağlam pupa deneyleri, hücre ve hayvan canlılığı üzerinde minimum etki ile birkaç saat çalışmasına izin veren, görüntüleme sırasında tractability ve dayanıklılık en iyi kombinasyonu sağladı. Yöntem olarak küçük, ya da daha küçük, kromozom sinek gibi özellikleri gözlem sağlar. Mikroskop ayarları ve montaj detayları ayarlanması, preparasyonun dahili zar komşu hücrelerin dinamiklerini ve bu tübülin gibi flüoresan etiketli proteinlerin görselleştirmek bırakıldı. Bu yöntem test edilen tüm floresan proteinleri için çalışıyor ve zaman ölçekleri çeşitli üzerinden Mikronaltı ölçek özelliklerini yakalayabilir. Geleneksel bir konfokal mikroskop ile pupa dış 20 um ile sınırlı olsa da, in vivo pupa dokularda protein ve dinamikleri hücresel gözlem için bu yaklaşım, bu hücre ve dokularda gelişimsel biyoloji çalışmaya genel olarak yararlı olabilir.
Introduction
Sirke sineği, Drosophila melanogaster. Drosophila araştırma anlatım, demonte ve mutasyonunu içeren gen manipülasyonu sofistike formları sağlar genetik deney zengin bir geçmişe sahiptir biyoloji birçok yönleriyle inceleyerek için iyi kurulmuş bir modeldir. Floresan proteini etiket gelişiyle, bu repertuar yaşayan hayvanlar hücre ve proteinlerin çalışmaları kapsayacak şekilde genişletti. Sinek embriyo in vivo 1-3 derin, yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan küçük ve optik net gibi çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Sinek gelişme diğer aşamaları anestezi 4, diseksiyon ve kısa vadeli kültürünü 5,6 veya 7,8 görüntüleme için manikür pencerelerin oluşturulmasına gerektiren, daha az uysal olduğu kanıtlanmıştır. Bu manipülasyonlar, genellikle uzun vadede hayvan gelişimi uzlaşma ya da kısa süreler için görüntüleme sınırı şekillerde hayvan etkiler.
En embriyonik hücre siklusu kesiliyor yana hücre siklus düzenleyicileri benzer genlerinde mutasyon roman incelemek için ent "> bu. hücre döngüsünün zamanlaması ve sadakat incelemek için uygun bir hazırlık bulmak için gerekli olan (SM veya S-G2-M) ve çalışma kapsamında mutantlar ileriki evrelere kadar, bu pupa aşaması dokularda hücre döngüsünü gözlemlemek için önemli kusurları görünmüyor. pupa epitel hücreleri daha tipik bir G1-S-G2-M hücre döngüsü ve bu aşamada pupa olan var kas hareketleri 9 yeteneğine sahip değildir. manipülasyonlar için başlangıç noktası pupa davanın belirgin donukluk rağmen Histone2AV-GFP ifade bozulmamış bütün pupa. dahil, bu bozulmamış hazırlık vivo görüntüleme uzun vadede mükemmel olduğunu kanıtladı. Bu teknik basittir lisans araştırmacılar rutin Drosophila hücre ve gelişim biyolojisi yönlerini incelemek için kullanabilirsiniz ve henüz çözünürlük mikrometre ölçekli özellikleri ayrımcılığı sağlayacak kadar gayet yeterli. Bu yöntemle, saat, dakika veya saniye içinde olayların gözlemleri sadece zaman serisi parametrelerini ayarlayarak mümkündür. Mavi, yeşil, sarı, turuncu ve kırmızı floresan proteinleri, veya bunların kombinasyonları kullanılarak Videolar yapılmıştır. Önemli olarak, eğer bakım hatta uzun süreli görüntüleme hayvanların geliştirme veya canlılığı üzerinde bir etkisi yoktur, lazer yoğunluğu en aza indirmek için alınır.Protocol
Representative Results
Discussion
Bölünen hücrelerin özellikleri, His2AvGFP ifade eden hücrelerin konfokal analizi ile Drosophila canlı pupa kanadında mitoz gözlemlemek için basit bir hazırlama gerekli geliştirme, görselleştirmek ölçmek ve ölçmek için. Bu yöntem, pupa kanadında hücre döngüsü onlar mitoz girmek epitelin apikal yüzeyine o çekirdekler hareket yalancı epiteliada döngüleri hücre güçlü benzerlikler taşıdığını belgelemek için kullanılmıştır. Telofaz ardından, çekirdekler geri epitel tabaka…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar entelektüel desteği, maddi destek ve hisse senetleri için Akira Chiba kabul etmek istiyoruz. Yorumlar için Julia Dallman teşekkürler.
Materials
| Fly stuff fly pad | Genesee scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas south | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas south | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine science tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular and subcellular features | |
| Immersion oil (non fluorescent) | |||
| Stereo microscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly’s perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
