Tilpasning af halvautomatiseret Cirkulerende Tumor Cell (CTC) analyser til kliniske og prækliniske forskning applikationer

Summary

Cirkulerende tumorceller (CTCs) er prognostisk i flere metastatiske cancere. Dette håndskrift beskriver guldstandarden CellSearch systemet (CSS) CTC tælling platform og fremhæver fælles misklassifikation fejl. Desuden er to tilpassede protokoller beskrevet for brugerdefineret markør karakterisering af CTCs og CTC optælling i prækliniske musemodeller af metastaser ved hjælp af denne teknologi.

Abstract

Størstedelen af ​​cancer-relaterede dødsfald sker efterfølgende til udviklingen af ​​metastatisk sygdom. Denne meget dødelige sygdom fase er forbundet med tilstedeværelsen af ​​cirkulerende tumorceller (CTCs). Disse sjældne celler har vist sig at være af klinisk betydning for metastatisk brystkræft, prostata-og tarmkræft. Den nuværende guldstandarden i klinisk CTC påvisning og tælling er FDA-godkendt CellSearch systemet (CSS). Dette håndskrift skitserer den standard protokol anvendes af denne platform, samt to yderligere tilpassede protokoller, der beskriver den detaljerede proces brugerdefineret markør optimering for protein karakterisering af patientens CTCs og en sammenlignelig protokol for CTC fange i meget lave mængder af blod, ved hjælp af standard CSS reagenser til at studere in vivo prækliniske musemodeller af metastaser. Derudover har forskellene i CTC kvalitet mellem rask donor blod tilsat celler fra vævskultur versus patient blod Samples fremhæves. Endelig er flere almindeligt afvigende elementer, der kan føre til CTC fejltarifering fejl skitseret. Tilsammen vil disse protokoller give en nyttig ressource for brugere af denne platform er interesseret i præklinisk og klinisk forskning vedrørende metastaser og CTCs.

Introduction

I 2013 anslås det, at 580.350 personer vil dø af kræft, og at 1.660.290 nye tilfælde af denne sygdom vil blive diagnosticeret i USA alene ^1. De fleste af disse dødsfald sker efterfølgende til udviklingen af metastatisk sygdom ^2. Den nuværende mangel på effektive behandlinger i behandling af metastaser og en begrænset forståelse af den metastatiske kaskade gør denne fase af sygdommen meget dødelig. Tilstedeværelsen af cirkulerende tumorceller (CTCs) i blodbanen har vist sig at korrelere med metastatisk sygdom ^3. Disse celler er ekstremt sjældne, og deres opdagelse er betegnende for den samlede overlevelse i metastatisk brystkræft ^4, prostata ^5, og kolorektal ⁶ cancer. Hos disse patienter er tilstedeværelsen af ​​≥ 5 (bryst og prostata), eller ≥ 3 (kolorektal) CTCs i 7,5 ml blod er tegn på dårligere prognose sammenlignet med de patienter med færre eller ingen påviselige CTCs i SAMe blodvolumen. Endvidere har ændringen i CTC antal under eller efter terapeutisk intervention vist sig at være nyttig som en indikator for behandlingsrespons, ofte hurtigere end de nuværende anvendte teknikker ^7-10.

Det er blevet anslået, at i metastatiske cancerpatienter CTCs sted med en frekvens på cirka 1 CTC per 10 ⁵ -10 ⁷ mononukleare celler og i patienter med lokaliseret sygdom, kan denne frekvens være endnu lavere (~ 1 i 10 ^8). Den sjældne art af disse celler kan gøre det vanskeligt præcist og pålideligt registrere og analysere CTCs ^11. Flere metoder (tidligere ^12-14 revideret) er blevet udnyttet til at berige og afsløre disse celler ved at udnytte egenskaber, der adskiller dem fra omgivende blodkomponenter. I almindelighed CTC tælling er en todelt proces, der kræver både en trin berigelse og påvisningstrin. Traditionelt berigelse skridt afhængige forskelle i physgiske egenskaber CTCs (cellestørrelse, densitet, deformerbarhed) eller på proteinmarkør ekspression (dvs. epitelcelleadhæsionsmolekyle [EpCAM] cytokeratin [CK]). Efter opformering kan CTC påvisning udføres på en række forskellige måder, hvoraf den mest almindelige er nukleinsyrebaserede assays og / eller cytometriske metoder. Hver af disse strategier er unikke, idet forskellige fordele og ulemper, men de mangler alle standardisering en nødvendighed for indgangen til det kliniske miljø. Den CellSearch systemet (CSS) blev derfor udviklet til at give en standardiseret metode til påvisning og tælling af sjældne CTCs i humant blod ved hjælp af fluorescens mikroskopi og antistof-baserede teknikker ^4-6. Denne platform er i øjeblikket betragtes som den gyldne standard i CTC opregning og er den eneste teknik, der er godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) til brug i klinikken ^15.

CSS er en to komponent platform consisting, (1) den CellTracks AutoPrep systemet (herefter benævnt forberedelse instrument), som automatiserer forberedelsen af humane blodprøver, og (2) den CellTracks Analyzer II (i det følgende benævnt analyse instrument), der scanner disse prøver efter forberedelse. For at skelne CTCs kontaminerende leukocytter forberedelse instrument anvender et antistof medieret, Ferrofluid-baserede magnetiske separation tilgang og differentieret fluorescens farvning. Indledningsvis etiketter systemet CTCs anvendelse af anti-EpCAM antistoffer konjugeret til jern nanopartikler. Prøven inkuberes derefter i et magnetfelt, og alle ikke-mærkede celler aspireres. Udvalgte tumorceller resuspenderet og inkuberet i en differentieret fluorescens plet bestående af fluorescens-mærkede antistoffer og en nuklear farvningsreagens. Endelig er prøven overført til en magnetisk patron, der kaldes en MagNest (i det følgende benævnt den magnetiske enhed), og scanned hjælp analyseinstrumentet.

Analysen instrument anvendes til at scanne fremstillede prøver ved hjælp af forskellige fluorescens-filtre, der hver er optimeret til den relevante fluorescerende partikel ved hjælp af en 10X objektiv. CTCs er identificeret som celler, der er bundet af anti-EpCAM, anti-pan-CK-phycoerythrin (PE) (CK8, 18 og 19), og det nukleare bejdse 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Omvendt er kontaminerende leukocytter identificeret som celler, der er bundet af anti-CD45-allophycocyanin (APC) og DAPI. Efter scanning, er computer-definerede potentielle tumorceller præsenteres for brugeren. Fra disse billeder skal brugeren anvende kvalitativ analyse under anvendelse af de definerede parametre og differentialfarvning diskuteret ovenfor for at bestemme, hvilke hændelser er CTCs.

Ud over at give en standardiseret metode til CTC optælling, CSS giver mulighed for molekylær karakterisering af CTCs baseret på proteinmarkører af interesse. Denne forespørgsel cen udføres på enkelt-celle niveau, ved hjælp af et fluoresceinisothiocyanat (FITC) fluorescens kanal ikke påkrævet for CTC identifikation ^16. Selv om denne platform giver evnen til molekylær karakterisering, den detaljerede proces protokol udvikling og optimering er ikke veldefineret. Tre kommercielt tilgængelige markører er blevet udviklet af producenten til brug med CSS, herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) og insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF-1R). HER2-analyse, i kombination med CSS, er blevet brugt af flere grupper til at illustrere potentialet for CTC karakterisering at informere den kliniske beslutningsproces og potentielt ændre de eksisterende retningslinjer for behandling. For eksempel Fehm et al. ¹⁷ viste, at cirka en tredjedel af brystkræftpatienter med HER2-primær tumorer havde HER2 ⁺ CTCs. Desuden Liu et al.18 for nylig rapporteret, at op til 50% af patienter med HER ⁺ metastatisk brystkræft ikke havde HER2 ⁺ CTCs. Herceptin, et HER2 receptor forstyrrende monoklonalt antistof påvist at være til fordel patienter, hvis tumorer udtrykker tilstrækkelige niveauer af HER2, er et almindeligt brugt til behandling af patienter med HER2 ⁺ primære tumorer ^19-21. Men disse undersøgelser tyder på, at Herceptin kan være sub-optimalt udnyttet, og at CTC karakterisering kan støtte i at forudsige behandlingsrespons. I sidste ende kan CTC karakterisering har potentiale til at forbedre personlig pleje.

CTC forskning er enestående, fordi det har i høj grad udnyttet en seng-til-bord-tilgang. Denne metode, i modsætning til benchtop-til-bedside forskning, som ofte kan tage år at påvirke patientpleje, har tilladt CTCs hurtig indtræden i kliniske omgivelser. Men læger er tilbageholdende med at bruge resultaterne fra CTC-analyse i patientbehandlingen beslutningsprocessen MAKning på grund af en manglende forståelse af deres underliggende biologi. Derfor bør relevante prækliniske musemodeller for metastaser og supplerende CTC analyseteknikker skal udnyttes med henblik på at undersøge disse udestående spørgsmål. Generelt er der to typer af prækliniske modeller, der anvendes til at studere den metastatiske kaskade, (1) spontan metastase modeller, som giver mulighed for undersøgelse af alle de trin i den metastatiske kaskade, og (2) eksperimentelle metastase modeller, som kun giver mulighed for studiet af senere trin i den metastatiske proces såsom ekstravasation og sekundær tumor dannelse ^22. Spontan metastase modeller involverer tumorcellevacciner injektioner i passende ortotopisk steder (f.eks injektion af prostatakræft celler i prostata for studiet af prostatakræft). Celler bliver derefter givet tid til at danne primære tumorer og spontant metastaserer til sekundære steder, såsom knogle, lunge og lymfeknuder. IDerimod eksperimentelle metastase modeller indebærer direkte indsprøjtning af tumorceller i blodbanen (fx via halevenen eller intrakardiel injektion til at målrette celler til specifikke steder), og derfor springe de indledende trin i intravasation og formidling til sekundære organer ^22. Således Langt størstedelen af CTC-analyse in vivo modelsystemer er blevet udført ved hjælp af enten cytometri-baserede ²³ eller tilpasset menneske-baserede CTC-teknikker (f.eks AdnaTest) ^24. Selvom nyttigt, ingen af ​​disse teknikker i tilstrækkelig grad afspejler CTC optælling ved hjælp af guldstandarden CSS. Baseret på den kliniske godkendelse, standardiseret karakter, og udbredt brug af CSS, vil udviklingen af en CTC opsamling og afsløring teknik til in vivo modellering, der bruger tilsvarende prøveforberedelse, forarbejdning og identifikationskriterier være fordelagtig, da resultaterne ville være sammenlignelige med de indhentet fra patientprøver. Men på grund af mængden REQuirements af præparatet instrument er det ikke muligt at bearbejde små volumener af blod ved hjælp af denne automatiske platform. . Desuden har tidligere arbejde af Eliane et al ²⁵ viste, at kontaminering af prøverne med muse epithelceller (som også opfylder standarden CTC definition [EpCAM ⁺ CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^-]) kan føre til forkert klassifikation af muse pladeepitelceller som CTCs. For at løse disse problemer en tilpasset teknik, der tillader udnyttelse af CSS CTC reagenser kombineret med en manuel isolation procedure blev udviklet. Tilføjelsen af ​​en FITC-mærket human leukocyt antigen (HLA)-antistof til Analysen tillader humane tumorceller kan skelnes fra muse pladeepitelceller.

Dette håndskrift beskriver standard kommercielt udviklet og optimeret CSS protokol til behandling af patientens blodprøver og almindelige faldgruber, som kan opstå, herunder discrepant elementer, der kan føre til CTC Fejlklassificering fejl. Desuden er tilpasning af CSS assay at undersøge brugerdefinerede protein karakteristika tilfangetagne CTCs og en tilsvarende tilpasset CSS teknik, der giver mulighed for berigelse og påvisning af CTCs fra små volumener af blod i prækliniske musemodeller for metastase beskrevet.

Protocol

Alle humane undersøgelser, der er beskrevet i dette manuskript blev udført under protokoller godkendt af Western University Human Research Ethics Board. Alle Dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med anbefalingerne fra den canadiske Rådet om Animal Care, under protokoller godkendt af Western University Animal Brug underudvalget. 1.. Standard CTC Enumeration fra patient Blodprøver Brug af CSS 1.. Menneskeblod Prøvetagning og forberedelse til forarbejdnin…

Representative Results

Standard CTC Enumeration Assay Følsomheden og specificiteten af ​​CSS er veldokumenteret i litteraturen. Men for at validere tilsvarende CTC opsving, spidse (1.000 LNCaP humane prostatacancerceller) og ikke-spikede blodprøver menneske fra raske frivillige donorer blev behandlet på CSS bruger standard CSSCTC protokollen. Som forventet, ikke-spikede prøver var fri for CTCs, 0,00 ± 0,00%, og CTC opsving blev påvist at være 86,9 ± 4,71% for spikede prøver (figur 1a). C…

Discussion

På trods af udviklingen af ​​mange nye CTC teknologier siden indførelsen af ​​CSS i 2004, denne teknik er stadig den eneste klinisk godkendte teknologi på markedet i dag, og derfor betragtes som den aktuelle gold standard for CTC påvisning og tælling. Dette håndskrift har vist, at selv om CSS har strenge krav til kvalitetskontrol kan det være genstand for fortolkning bias og at CTC identifikation i patientprøver er meget anderledes fra identifikation i spidse prøver. Blev identificeret seks kategorier a…

Materials

REAGENTS
0.5M EDTA
Anti-human CD44-FITC	BD Pharmigen	555478
Anti-human CD44-PE	BD Pharmigen	555479
Anti-human HLA-AlexaFluor488	BioLegend	311415
Anti-mouse CD45-APC	eBioscience	17-0451-82
Bond Primary Antibody Diluent	Leica	AR9352
CellSave Preservative Tubes	Veridex	952820 (20 pack)                      79100005 (100 pack)
CellSearch CTC Control Kit	Veridex	7900003
CellSearch CTC Kit	Veridex	7900001
CellSearch CXC Control Kit	Veridex	7900018RUO
CellSearch CXC Kit	Veridex	7900017RUO
Instrument Buffer	Veridex	7901003
Streck Cell Preservative (aka CytoChex)	Streck	213350
EQUIPMENT
1 ml syringe
10 ml serological pipette
1000µl pipette
1000µl pipette tips
12 x 75mm flow tubes
200µl gel loading tips
200µl pipette
22 gauge needle
5 3/4" disposible pasteur pipet	VWR	14672-200
5 ml serological pipette
Automated pipettor
Capillary Blood Collection Tube (EDTA)	BD Microtainer	365974
CellSearch Analyzer II	Veridex	9555	Includes magnests and verification cartirdges
CellSearch AutoPrep System	Veridex	9541
Centrifuge
MagCellect Magnet	R&D Systems	MAG997
Small Latex Bulb	VWR	82024-550
Vortex