Zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in mehreren metastatischen Krebsprognos. Dieses Manuskript beschreibt den Goldstandard Cellsearch System (CSS) CTC Aufzählung Plattform und Highlights gemeinsame Fehlklassifikation Fehler. Darüber hinaus werden zwei angepasste Protokolle für benutzerdefinierte Marker Charakterisierung von CTC und CTC Aufzählung in präklinischen Mausmodellen der Metastasierung mit dieser Technologie beschrieben.
Die Mehrheit der durch Krebs verursachten Todesfälle treten im Anschluss an die Entwicklung von Metastasen. Diese hoch tödliche Krankheit Stufe mit dem Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) zugeordnet ist. Diese seltenen Zellen wurde gezeigt, dass der klinische Bedeutung bei metastasierendem Brust-, Prostata-, und Darmkrebs sein. Der aktuelle Gold-Standard in der klinischen CTC Nachweis und die Zählung ist die FDA-Zulassung Cellsearch System (CSS). Dieses Manuskript beschreibt die Standard-Protokoll, das von dieser Plattform genutzt sowie zwei zusätzliche angepasste Protokolle, die den detaillierten Prozess von benutzerdefinierten Marker-Optimierung für die Protein-Charakterisierung von Patienten CTC und einem vergleichbaren Protokoll für CTC Erfassung in sehr geringen Mengen an Blut zu beschreiben, mit Standard- CSS Reagenzien zur Untersuchung von in vivo präklinischen Mausmodellen der Metastasierung. Darüber hinaus Unterschiede in der Qualität zwischen CTC gesunden Spenderblut, versetzt mit Zellen aus Gewebekultur gegenüber Patienten Blut samples werden hervorgehoben. Schließlich werden mehrere häufig abweichende Positionen, die CTC Fehlklassifikation Fehlern führen kann skizziert. Zusammengenommen werden diese Protokolle eine nützliche Ressource für die Nutzer dieser Plattform interessiert in der präklinischen und klinischen Forschung im Zusammenhang mit der Metastasierung und CTC werden.
Im Jahr 2013 wird geschätzt, dass 580.350 Menschen an Krebs sterben und dass 1.660.290 neue Fälle dieser Krankheit wird allein in den USA 1 diagnostiziert werden. Die meisten dieser Todesfälle treten im Anschluß an die Entwicklung von Metastasen 2. Der derzeitige Mangel an wirksamen Therapien in der Behandlung von Metastasen und eine begrenzte Verständnis der metastatischen Kaskade macht dieses Stadium der Erkrankung sehr tödlich. Das Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in die Blutbahn wurde gezeigt, dass mit Metastasen 3 korrelieren. Diese Zellen sind extrem selten und ihr Nachweis bei metastasierendem Brust 4, 5 Prostata bezeichnend für das Gesamtüberleben und kolorektalem Krebs 6. Bei diesen Patienten ≥ 5 (Brust-und Prostatakrebs) oder ≥ 3 (kolorektalen) CTC in 7,5 ml Blut ist das Vorhandensein von bezeichnend für schlechtere Prognose im Vergleich zu den Patienten mit weniger oder ohne nachweisbare CTC in der same Blutvolumen. Außerdem wurde die Änderung der Anzahl CTC während oder nach der therapeutischen Intervention nachgewiesen, die als Prädiktor für die Behandlung angesprochen, oft früher als gegenwärtig verwendeten Techniken 7-10 sein.
Es wurde geschätzt, dass in metastatischen Krebspatienten, CTC treten mit einer Häufigkeit von etwa 1 pro CTC 10 5 -10 7 mononukleären Blutzellen und bei Patienten mit lokalisierter Erkrankung kann diese Frequenz auch niedriger sein (1 ~ 10 in 8). Die seltene Art dieser Zellen kann es schwierig machen, genau und zuverlässig zu erfassen und zu analysieren, CTC 11. Mehrere Verfahren (vorher 12-14 prüft) verwendet worden, um durch Ausnutzung Eigenschaften, die sie von den umgebenden Blutkomponenten unterscheiden bereichern und erkennen diese Zellen. Im allgemeinen ist CTC Aufzählung ein zweiteiliges Verfahren, das sowohl eine Anreicherungsschritt und einen Erfassungsschritt erfordert. Traditionell verlassen Anreicherungsschritte auf Unterschiede in phys.schen Eigenschaften von CTC (Zellgröße, Dichte, Verformbarkeit) oder Protein-Marker-Expression (dh Epithelial Cell Adhesion Molecule [EpCAM], Cytokeratin [CK]). Nach Anreicherung kann CTC Detektion in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, von denen die häufigsten sind Nukleinsäure-basierte Assays und / oder durchflusszytometrische Ansätze durchgeführt werden. Jede dieser Strategien sind einzigartig, mit unterschiedlichen Vor-und Nachteile, aber sie alle nicht standardisiert, eine Notwendigkeit für den Eintritt in die klinische Einstellung. Das Cellsearch System (CSS) wurde daher entwickelt, um eine standardisierte Methode zum Nachweis und zur Zählung von seltenen CTC in menschlichem Blut unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und Antikörper-basierte Techniken 4-6 bereitzustellen. Diese Plattform wird derzeit als der Goldstandard in der CTC-Enumeration und ist der einzige von der US Food and Drug Administration (FDA) für den Einsatz in der Klinik 15 bewährte Technik.
Die CSS ist ein Zwei-Komponenten-Plattform consisting, (1) die CellTracks AutoPrep System (nachstehend als Präparationsinstrument bezeichnet), welche die Herstellung von menschlichen Blutproben, und (2) die CellTracks Analyzer II (nachstehend als Analyseinstrument bezeichnet), die diese Scans automatisiert Proben nach der Vorbereitung. Um CTC verunreinigen Leukozyten die Vorbereitung Instrument unterscheiden beschäftigt ein Antikörper vermittelt wird, Ferrofluid-basierten Ansatz, magnetische Trennung und Differenzfluoreszenzfärbung. Zunächst markiert der CTC-System mit Anti-EpCAM-Antikörper gegen Eisen-Nanopartikel konjugiert. Die Probe wird dann in einem Magnetfeld inkubiert und alle unmarkierten Zellen abgesaugt. Ausgewählte Tumorzellen resuspendiert und inkubiert in einem Differenz Fluoreszenz-Färbung, bestehend aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern und eine Kernfärbung Reagenz. Schließlich wird die Probe einem magnetischen Kassette übertragen, genannt magnest (nachfolgend als Magneteinrichtung bezeichnet) und scanned mit dem Analyseinstrument.
Das Analysegerät wird verwendet, um mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Filter, die jeweils mit der geeigneten Fluoreszenzpartikel optimiert, mit einem 10x-Objektiv vorbereiteten Proben scannen. CTCs als Zellen, die durch Anti-EpCAM-, Anti-Pan-CK-Phycoerythrin (PE) gebunden sind (CK8, 18 und 19) und die Kernfärbung 4 ',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) identifiziert. Umgekehrt werden die kontaminierenden Leukozyten Zellen, die durch Anti-CD45-Allophycocyanin (APC) und DAPI gebunden werden identifiziert. Nach dem Abtasten werden Computer-definierten potentiellen Tumorzellen, die dem Benutzer präsentiert. Aus diesen Bildern, muss der Benutzer die qualitative Analyse zu verwenden mit den definierten Parametern und Differenzialfärbungs oben erörtert, um zu bestimmen, welche Ereignisse CTC.
Zusätzlich zur Bereitstellung einer standardisierten Methode zur CTC Aufzählung ermöglicht molekulare Charakterisierung von CTCs bezogen auf Protein-Marker von Interesse der CSS. Diese Abfrage cauf Einzelzellebene eine durchgeführt werden, wobei ein Fluorescein (FITC) Fluoreszenzkanal nicht für CTC Identifikations 16 erforderlich. Obwohl diese Plattform bietet die Fähigkeit zur molekularen Charakterisierung, der detaillierte Prozess der Entwicklung von Protokollen und Optimierung nicht gut definiert. Drei kommerziell erhältlichen Markern wurden vom Hersteller zur Verwendung mit der CSS, einschließlich epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-1 Rezeptor (IGF-1R) entwickelt. HER2-Analyse, in Kombination mit der CSS, wurde von mehreren Gruppen genutzt werden, um das Potenzial für CTC Charakterisierung veranschaulichen, um die klinische Entscheidungsfindung zu informieren und eventuell vorhandenen Behandlungsrichtlinien zu ändern. Zum Beispiel Fehm et al. Zeigten, dass 17 etwa ein Drittel der Brustkrebs-Patientinnen mit HER2-Primärtumoren hatten HER2 + CTC. Zusätzlich Liu et al.18 vor kurzem berichtet, dass bis zu 50% der Patienten mit HER + metastasierendem Brustkrebs nicht haben HER2 + CTC. Herceptin, ein HER2-Rezeptor stören monoklonalen Antikörper nachgewiesen, dass Patienten, deren Tumore HER2 ausreichend, ist ein häufig genutzt Behandlung für Patienten mit HER2 + Primärtumoren 19-21 stark profitieren. Allerdings deuten diese Studien, dass Herceptin kann als Sub-optimal genutzt und das CTC Charakterisierung kann bei der Vorhersage Ansprechen auf die Behandlung zu unterstützen. Letztlich kann CTC Charakterisierung haben das Potenzial, individuelle Betreuung zu verbessern.
CTC Forschung ist einzigartig, es ist weitgehend eine Nacht-zu-Tisch-Ansatz verwendet. Diese Methode, die im Gegensatz zu Tisch-zu-Bett Forschung, die oft Jahre kann die Patientenversorgung auswirken, hat CTC schnellen Einstieg in die klinischen Einstellung erlaubt. Allerdings sind Ärzte zögern, die Ergebnisse von CTC-Analyse in der Patientenbehandlung Entscheidungs mak verwendenten durch einen Mangel an Verständnis der zugrunde liegenden Biologie. Daher geeigneten präklinischen Mausmodellen der Metastasierung und komplementäre Analysetechniken CTC müssen, um diese offenen Fragen untersuchen genutzt werden. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Tiermodellen verwendet werden, um die metastatischen Kaskade untersuchen: (1) spontane Metastasierung Modelle, die für die Untersuchung aller Schritte in der metastatischen Kaskade zu ermöglichen, und (2) experimentelle Metastasierung Modellen, die nur ermöglichen, das Studium der späteren Schritte in der metastatischen Prozess wie Extravasation und sekundären Tumorbildung 22. Spontane Metastasierung Modelle beinhalten Tumorzellinjektionen in geeignete orthotopen Stellen (zB Injektion von Prostata-Krebszellen in der Prostata für die Untersuchung von Prostatakrebs). Die Zellen werden dann Zeit, um Primärtumoren bilden und spontan auf sekundären Standorten wie der Knochen, Lunge und Lymphknoten metastasieren gegeben. InDagegen experimentellen Metastasierung Modelle direkte Injektion von Tumorzellen in die Blutbahn (z. B. über Schwanzvene oder intrakardiale Injektion, um Zellen gezielt an bestimmte Stellen) und damit die ersten Schritte Intravasation und Verbreitung zum sekundären Organe 22. So weit die Mehrheit der CTC-Analyse in in vivo Modellsystemen durchgeführt wurde entweder mit Durchflusszytometrie-basierte 23 oder angepasst menschlichen CTC-basierte Techniken (zB AdnaTest) 24. Obwohl nützlich, keine dieser Techniken angemessen widerspiegeln CTC Aufzählung mit dem Gold-Standard CSS. Bezogen auf die klinische Zulassung standardisierte Art und weit verbreiteten Nutzung des CSS wäre die Entwicklung eines CTC Fänger-und Nachweisverfahren für die in vivo-Modellierung, die äquivalent der Probenvorbereitung, die Verarbeitung verwendet, und Identifizierungskriterien vorteilhaft als Ergebnis wäre vergleichbar mit denen aus Patientenproben erhalten. Jedoch aufgrund der Volumen requirements des Präparationsinstruments ist es nicht möglich, kleine Mengen an Blut mit diesen automatisierten Plattform verarbeitet. . Außerdem früheren Arbeit von Eliane et al 25 hat gezeigt, dass eine Kontamination der Proben mit der Maus Epithelzellen (die auch die Standard-CTC Definition [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -] erfüllen) kann zu Fehlklassifikation von Maus Plattenepithel Epithelzellen führen CTC. Um diese Probleme anzugehen eine angepasste Technik, die die Nutzung der CSS-CTC-Kit-Reagenzien in Kombination mit einem manuellen Isolationsverfahren wurde entwickelt, ermöglicht. Die Zugabe eines FITC-markierten humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Antikörpers zu dem Assay ermöglicht menschlichen Tumorzellen aus Maus Plattenepithelzellen unterscheiden.
Dieses Manuskript beschreibt die Standard-, kommerziell entwickelte und optimierte CSS-Protokoll für die Verarbeitung von Patientenblutproben und Fallstricke, die auftreten können, einschließlich Abweit Elemente, die CTC Fehlklassifikation Fehlern führen kann. Zusätzlich Anpassung der CSS-Test, benutzerdefinierte Proteineigenschaften von CTC erfasst und vergleichbarer angepasst CSS-Technik, die für die Anreicherung und den Nachweis von CTC von kleinen Blutvolumina in präklinischen Mausmodellen von Metastasen ermöglicht untersuchen beschrieben.
Trotz der Entwicklung vieler neuer Technologien CTC seit der Einführung der CSS im Jahr 2004, ist diese Technik immer noch die einzige klinisch bewährte Technologie auf dem Markt, und deshalb wird es als der aktuelle Goldstandard für die CTC-Nachweis und die Zählung. Diese Handschrift hat gezeigt, dass, obwohl die CSS hat strenge Qualitätskontrollen kann es für die Auslegung Bias sein und das CTC-Identifikation in Patientenproben ist in dotierten Proben viel anders als Identifikation. Sechs Kategorien von häufig …
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ontario Institute of Cancer Research (# 08NOV230), der Canada Foundation for Innovation (# 13199), Prostatakrebs Kanada, Janssen Onkologie, dem London Regional Cancer Program, und die Unterstützung der Geber von John und Donna Bristol unterstützt durch die London Health Sciences Foundation (ALA). UEG wird von einem Frederick Banting und Charles Best Canada Graduate Scholarship-Doktorandenpreis unterstützt. ALA wird von einem CIHR New Investigator Award und einer früh Researcher Award von der Ontario Ministerium für Forschung und Innovation unterstützt.
REAGENTS | |||
0.5M EDTA | |||
Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
Anti-human HLA-AlexaFluor488 | BioLegend | 311415 | |
Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
EQUIPMENT | |||
1 ml syringe | |||
10 ml serological pipette | |||
1000µl pipette | |||
1000µl pipette tips | |||
12 x 75mm flow tubes | |||
200µl gel loading tips | |||
200µl pipette | |||
22 gauge needle | |||
5 3/4" disposible pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
5 ml serological pipette | |||
Automated pipettor | |||
Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
Centrifuge | |||
MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
Vortex |