임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응
Summary
순환 성 종양 세포 (의 CTCs)는 몇개의 전이성 암에서 예후이다. 이 원고는 금 본위제 CellSearch 시스템 (CSS) CTC 열거 플랫폼과 주요 공통의 오 분류 오류에 대해 설명합니다. 또한, 두 개의 적응 프로토콜은이 기술을 사용하여 전이의 전임상 마우스 모델에서의 CTCs 및 CTC 열거 형의 사용자 정의 마커의 특성에 대해 설명합니다.
Abstract
암 관련 사망의 대다수는 전이성 질환의 발달 이후 발생한다. 이 높은 치명적인 질병 단계는 종양 세포 (의 CTCs)를 순환의 존재와 연결되어 있습니다. 이 희귀 한 세포는 전이성 유방암, 전립선 암, 대장 암의 임상 적 의미의 것으로 입증되었다. 임상 CTC 탐지 및 열거 형의 현재 금 표준은 FDA의 허가 CellSearch 시스템 (CSS)입니다. 이 원고는 표준이 플랫폼에 의해 사용 프로토콜 등을 설명 표준을 사용하여, 환자의 CTCs 단백질 특성 분석을위한 사용자 정의 마커 최적화 및 혈액의 매우 낮은 볼륨에서 CTC 캡처를위한 동급 프로토콜의 자세한 과정을 설명하는 두 개의 추가 적응 프로토콜 CSS 시약, 전이의 생체 내 전임상 마우스 모델에서 공부하십시오. 또한, 건강한 기증자의 혈액 사이의 CTC 품질의 차이는 환자의 혈액 SAMP 대 조직 배양에서의 세포와 스파이크레는 강조 표시됩니다. 마지막으로, CTC의 오 분류 오류가 발생할 수있는 몇 가지 일반적으로 불일치 항목이 설명되어 있습니다. 이와 함께,이 프로토콜은 전이와의 CTCs에 관한 전임상 및 임상 연구에 관심이 플랫폼의 사용자를위한 유용한 리소스를 제공 할 것입니다.
Introduction
2013 년에 그것은 580,350 개인이 암으로 사망 할 것으로 추정되고,이 질병의 1,660,290 새로운 사건이 혼자 1 미국에서 진단을 것입니다. 이 죽음의 대다수는 전이성 질환이 개발 이후 발생한다. 전이 및 전이성 폭포의 제한된 이해를 치료에 효과적인 치료의 현재 부족은 질병의이 단계가 매우 치명적 있습니다. 혈액 내 종양 세포 (의 CTCs)를 순환의 존재는 전이성 질환 3와 상관 관계가 입증되었다. 이 세포는 매우 희귀하고 자신의 검출은 전이성 유방암 4, 전립선 암 5 년 생존율을 나타내는이며, 대장 암 6. 적은 수를 가진 환자 또는 샘 없음 감지 CTCs를 비교할 때 이러한 환자에서의 존재는 ≥ 5 (유방암과 전립선) 또는 혈액의 7.5 ML에서 ≥ 3 (대장)의 CTCs는 가난한 예후를 나타낸다전자 혈액량. 또한, 치료 적 개입 동안이나 후에 CTC 번호의 변화는 종종 빨리 현재 활용 기술보다 7-10, 치료 반응의 예측으로 유용한 것으로 입증되었다.
그것은 전이성 암 환자에서의 CTCs 10 5 -10 7 혈액 단핵 세포 당 약 1 CTC의 주파수에서 발생하고 지역화 된 질병을 가진 환자에서,이 주파수 (1 ~ 8 10 ~) 더 낮은있을 수 있습니다 것으로 추정하고있다. 이러한 세포의 희귀 한 자연 어려운 정확하고 신뢰성의 CTCs (11)를 감지하고 분석 할 수 있습니다. 여러 가지 방법 (이전에 12 ~ 14 리뷰) 혈액 성분을 주변에서 그들을 차별화하는 특성을 이용하여이 세포를 풍부하게하고 감지하기 위해 사용되었다. 일반적으로, CTC 열거 형은 농축 단계와 탐지 단계를 모두 필요로하는 과정은 두 단계로 이루어집니다. 전통적으로 농축 단계 인 phys의 차이에 의존의 CTCs (셀 크기, 밀도, 변형성) 또는 단백질 마커의 발현에 (즉, 상피 세포 접착 분자 [EpCAM] 아세포 [CK])의 iCal의 속성. 농축 후, CTC 검출 핵산 기반 분석 및 / 또는 유세포 접근법 가장 일반적인있는 다른 방법은, 다수로 수행 될 수있다. 이러한 전략은 각각 별개의 장점과 단점을 가지고, 그러나 그들은 모두 표준화 부족, 독특하고 임상에 입학 필요. CellSearch 시스템 (CSS)을 따라서, 형광 현미경 및 항체 기반 기술 4-6을 사용하여 인간의 혈액에있는 드문의 CTCs의 탐지 및 열거하기위한 표준화 된 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 이 플랫폼은 현재 CTC 열거 형의 황금 표준으로 간주하고 병원 15에 사용하기 위해 미국 식품 의약청 (FDA)에 의해 승인 된 유일한 기술입니다.
CSS는 두 가지 구성 요소 플랫폼 consistin입니다의 g, 사람의 혈액 샘플을 준비하고, 이들을 검사 (이하, 분석 기기 라 함) (2) CellTracks 분석기 II를, 자동화 (이하, 제조 기기 라 함) (1) CellTracks AutoPrep 시스템 준비 다음 샘플. 백혈구에게 준비 기기를 오염의 CTCs를 구별하려면 매개 항체, 자성 유체 기반의 자기 분리 방법 및 차등 형광 염색 사용합니다. 처음에, 시스템은 철 나노 입자에 접합 된 항-EpCAM 항체를 사용의 CTCs 라벨. 시료를 자계에서 배양하고, 모든 비 표지 세포를 흡인한다. 선택된 종양 세포의 형광 표지 된 항체 및 핵 염색 시약을 구성된 차동 형광 염색에 재현 탁하고 인큐베이션. 마지막으로, 시료를 자기 카트리지로 전송 (이하, 자기 장치로 지칭) MagNest 부르고, SC된다분석 기기를 사용 anned.
분석 기기는 10X 대물 렌즈를 이용하여, 서로 다른 형광 필터, 적합한 형광 입자에 최적화 된 각을 이용하여 준비된 시료를 검사하는 데 사용된다. 의 CTCs는 반대로 EpCAM, 안티 팬 CK-피코 에리 트린 (PE)에 의해 결합되어 세포 (CK8, 18, 19), 핵 얼룩 4 ', 6 – diamidino -2 – 페닐 인돌 (DAPI)로 식별됩니다. 반대로, 오염 백혈구는 항 CD45-알로 피코 (APC) 및 DAPI에 구속되는 세포로 식별됩니다. 주사 후, 컴퓨터에 정의 전위 종양 세포가 사용자에게 제시된다. 이러한 이미지로부터, 사용자는 이벤트의 CTCs 있다고 판단하는 상술 정의 파라미터 및 차동 염색법을 사용하여 정성 분석을 채택한다.
CTC 열거를위한 표준화 된 방법을 제공하는 것 외에도, CSS는 그 단백질 마커에 기초의 CTCs 분자 특성화를 허용한다. 이 심문 C이 CTC 식별 16에 필요하지 형광 염료 (FITC) 형광 채널을 이용해 단일 셀 레벨에서 수행 될 수있다. 이 플랫폼은 분자 특성의 용량을 제공하지만, 프로토콜 개발 및 최적화의 자세한 과정은 잘 정의되어 있지 않습니다. 세 시판 마커는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 및 인슐린 – 유사 성장 인자 -1 수용체 (IGF-1R) 등 CSS와 함께 사용하기 위해 제조자에 의해 개발되었다. HER2 분석은 CSS와 함께, 임상 의사 결정을 알리기 위하여 기존 및 잠재적 치료 지침을 변경할 CTC 특성화 가능성을 설명하기 위해 여러 그룹에 의해 이용되었다. 예를 들어, Fehm 등. (17)는 HER2-기본 종양 유방암 환자의 약 삼분의이 HER2 +의 CTCs이 있었다는 것을 보여 주었다. 또한, 리우 등.(18)는 최근 그녀의 + 전이성 유방암 환자의 50 %가 HER2 +의 CTCs을하지 않았다고 보도했다. 허셉틴, 크게 그 종양 HER2 충분한 수준의 표현, HER2 + 기본 종양 19-21 환자에 대한 일반적으로 사용 치료 환자에게 이익을 보여 단일 클론 항체를 방해 HER2 수용체. 그러나 이러한 연구는 허셉틴이 하위 최적 활용과 CTC의 특성은 치료 반응을 예측하는데 도움이 될 수 있다는 것을 할 수 있다는 것을 권 해드립니다. 궁극적으로, CTC 특성화 개인화 치료를 개선하기위한 가능성을 가지고있다.
그것은 주로 침대 – 투 – 벤치 탑 접근 방식을 활용하고있다 점에서 CTC의 연구는 고유합니다. 이 방법은 종종 환자 치료에 영향을 줄 수 년이 걸릴 수있는 벤치 탑 – 투 – 머리맡의 연구와는 달리, 임상에의 CTCs 빠른 입력을 허용했다. 그러나, 의사는 환자의 치료 결정 MAK에서 CTC 분석 결과를 사용하기 꺼려인해 기본 생물학에 대한 이해의 부족으로 보내고. 따라서 전이 보완 CTC 분석 기술의 적절한 전임상 마우스 모델이 뛰어난 질문을 조사하기 위해 사용되어야합니다. 일반적으로, 전이성 캐스케이드의 모든 단계의 연구를 허용 전이성 캐스케이드를 연구하는 데 전임상 모델의 두 종류 (1) 자발적 전이 모델이있다과는 허용 (2) 실험 전이 모델 이러한 혈관 외 유출 및 보조 종양 형성 (22)과 전이 과정에서 이후 단계의 연구. 자발적 전이 모델은, 적절한 동 소성 명소 (전립선 암 연구 전립선에 전립선 암 세포의 예 주입)으로 종양 세포 주입을 수반한다. 세포는 다음 주 종양을 형성하고 자발적으로 이러한 뼈, 폐, 림프절 등의 보조 사이트에 전이 시간이 주어집니다. 에반면, 실험 전이 모델 (특정 위치에 셀을 대상으로 꼬리 정맥 또는 심장 내 주사 등을 통해) 혈류로 종양 세포의 직접 주입을 포함하기 때문에 보조 기관 (22)에 intravasation 보급의 초기 단계를 건너 뜁니다. 지금까지 생체 내 모델 시스템에서 CTC 분석의 대부분은 세포 계측법 기반 (23) 또는 적응 인간 기반 CTC 기법 (예 AdnaTest) (24)를 사용하여 수행되었다. 유용하지만, 이러한 기술 중 어느 것도 적절 골드 표준 CSS를 사용하여 CTC 열거 형을 반영하지 않습니다. 결과 것과 비교 될 것이라고 임상 승인 표준화 활동 및 CSS의 광범위한 사용에 따라, 상응하는 샘플 준비, 가공을 이용하는 생체 모델링 CTC 포획 및 검출 기술, 및 식별 기준의 개발이 유익 할 것이다 환자 샘플에서 얻은. 그러나, 볼륨 REQ 행제조 장비의 uirements는이 자동화 플랫폼을 사용하여 혈액의 작은 볼륨을 처리 할 수 없다. .로 마우스 편평 상피 세포의 오 분류로 이어질 수 있습니다 – 또한, Eliane 등 (25)에 의해 이전 작업 (또한 표준 CTC 정의 [EpCAM + CK + DAPI + CD45]을 만족) 마우스 상피 세포 샘플의 오염이 있음을 보여 주었다 의 CTCs. 이러한 문제에게 수동 격리 절차와 결합 된 CSS CTC 키트 시약의 활용이 개발 한 수있는 적응 기술을 해결합니다. 상기 분석으로 FITC 표지 된 인간 백혈구 항원 (HLA) 항체의 첨가는 인간 종양 세포는 마우스 편평 상피 세포로부터 구별 될 수있다.
이 원고는 discrepan 포함하여 발생할 수있는 환자의 혈액 샘플 및 일반적인 함정을 처리하기위한 상업적으로 개발 표준 및 CSS 최적화 된 프로토콜을 설명합니다CTC의 오 분류 오류가 발생할 수 있습니다 t 항목. 또한, 촬영의 CTCs과 전이의 전임상 마우스 모델에서 혈액의 작은 볼륨에서의 CTCs 농축 및 탐지를 허용하는 비교 적응 CSS 기술의 사용자 정의 단백질의 특성을 검토하는 CSS 분석의 정의가 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
2004 년에 CSS의 도입 이후 많은 새로운 CTC 기술의 발전에도 불구하고,이 기술은 오늘날 시장에서 유일하게 임상 적으로 승인 된 기술이며, 따라서 그것은 CTC 탐지 및 열거 형에 대한 현재 황금 표준으로 간주됩니다. 이 원고는 CSS는 엄격한 품질 관리 기준을 가지고 있지만 그것을 해석 편견의 대상이 될 환자 샘플에서 CTC 식별이 아군 샘플의 식별과 크게 다를 수 있다는 것을 보여 주었다. 일반적으?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 암 연구의 온타리오 연구소 (# 08NOV230), 혁신에 대한 캐나다 재단 (# 13199), 전립선 암, 캐나다, 얀센 종양학, 런던 지역 암 프로그램, 존 도나 브리스톨에서 기증자의 지원을 통해에서 교부금에 의해 지원되었다 (ALA에) 런던 건강 과학 재단. LEL은 프레 더릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 박사 수상에 의해 지원됩니다. ALA는 CIHR 새로운 탐정 수상 및 연구와 혁신의 온타리오 교육부에서 조기 연구원 상에 의해 지원됩니다.
Materials
| REAGENTS | |||
| 0.5M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-AlexaFluor488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| EQUIPMENT | |||
| 1 ml syringe | |||
| 10 ml serological pipette | |||
| 1000µl pipette | |||
| 1000µl pipette tips | |||
| 12 x 75mm flow tubes | |||
| 200µl gel loading tips | |||
| 200µl pipette | |||
| 22 gauge needle | |||
| 5 3/4" disposible pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
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