Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa

Summary

As células tumorais circulantes (CTCs) são prognóstico em vários tipos de câncer metastático. Este manuscrito descreve o sistema padrão ouro CellSearch (CSS) CTC plataforma enumeração e destaca os erros comuns erros de classificação. Além disso, dois protocolos adaptados são descritos para o marcador caracterização definida pelo usuário de CTCs e CTC enumeração em modelos de ratos pré-clínicos de metástase que utilizam esta tecnologia.

Abstract

A maioria das mortes relacionadas ao câncer ocorrem subseqüente para o desenvolvimento da doença metastática. Este estádio da doença altamente letal está associada com a presença de células tumorais (CTCs) circulante. Estas células raras foram demonstrou ser de relevância clínica em mama metastático, próstata e colorretal. O atual padrão ouro na detecção clínica CTC e enumeração é o sistema CellSearch aprovado pela FDA (CSS). Este manuscrito descreve o protocolo padrão utilizado por esta plataforma, bem como dois protocolos adicionais adaptados que descrevem o processo detalhado de optimização marcador definido pelo utilizador para a caracterização da proteína de CTC paciente e um protocolo similar para o CTC captura em volumes muito baixos de sangue, usando o padrão reagentes de estilo CSS, para estudar em modelos de ratos pré-clínicos in vivo de metástase. Além disso, as diferenças de qualidade entre CTC sangue doador saudável enriquecida com células de cultura de tecidos contra samp sangue do pacienteles são realçados. Finalmente, vários itens comumente discrepantes que podem levar a erros de classificação do CTC são delineadas. Tomados em conjunto, estes protocolos irá fornecer um recurso útil para os utilizadores desta plataforma interessados ​​em pesquisa pré-clínica e clínica pertencente a metástase e CTCs.

Introduction

Em 2013 estima-se que 580.350 pessoas morrerão de câncer e que 1.660.290 novos casos da doença serão diagnosticados nos Estados Unidos sozinho ^1. A maioria das mortes ocorrem subsequente ao desenvolvimento da doença metastática ^2. A atual falta de terapias eficazes no tratamento de metástases e uma compreensão limitada da cascata metastática faz nesta fase da doença altamente letal. A presença de células tumorais circulantes (CTCs) na corrente sanguínea tem sido demonstrada estar correlacionada com doença metastática ^3. Estas células são extremamente raros e a sua detecção é indicativo de sobrevida de mama metastático ^{4, 5} da próstata, colo-rectal e cancro da ^6. Nestes pacientes, a presença de ≥ 5 (mama e próstata) ou ≥ 3 (colorectal) CTC em 7,5 ml de sangue é indicativo de um pior prognóstico quando comparado com os pacientes com menos ou nenhuma CTC detectáveis ​​na samvolume de e sangue. Além disso, a alteração no número CTC durante ou após intervenção terapêutica tem sido demonstrado ser úteis como um indicador da resposta ao tratamento, muitas vezes, mais cedo do que as técnicas actualmente utilizadas ^7-10.

Estimou-se que, em pacientes com cancro metastático, CTC ocorrem com uma frequência de cerca de 1 por CTC 10 ⁵ -10 ⁷ células mononucleares de sangue e em pacientes com doença localizada, essa frequência pode ser ainda mais baixa (~ 1: 10 ^8). A natureza raras dessas células pode tornar difícil a precisão e fiabilidade detectar e analisar CTC ^11. Vários métodos (avaliação previamente ^12-14) têm sido utilizados para o enriquecimento e detectar estas células através da exploração de propriedades que os diferenciam dos componentes do sangue circundante. Em geral, CTC enumeração é um processo de duas etapas que exige uma etapa de enriquecimento e um passo de detecção. Tradicionalmente, as etapas de enriquecimento de contar com as diferenças de Physpropriedades iCal de CTCs (tamanho da célula, densidade, deformabilidade) ou na expressão de marcador de proteína (ou seja, a molécula de adesão de células epiteliais [EpCAM], citoqueratina [CK]). Seguindo o enriquecimento, a detecção CTC pode ser realizada em um número de maneiras diferentes, sendo o mais comum dos quais são os ensaios baseados em ácidos nucleicos e / ou citometria de abordagens. Cada uma dessas estratégias são únicos, com vantagens e desvantagens, no entanto todos eles não têm padronização; uma necessidade para a entrada no ambiente clínico. O sistema CellSearch (CSS), foi desenvolvido para proporcionar um método normalizado para a detecção e enumeração de CTC raras no sangue humano, através de microscopia de fluorescência e técnicas à base de anticorpos ^4-6. Esta plataforma é actualmente considerado o padrão ouro no CTC enumeração e é a única técnica aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA) para uso na clínica ^15.

O CSS é um dois consistin plataforma componenteg, (1) o sistema CellTracks Autoprep (doravante referido como o instrumento de preparação), que automatiza a preparação de amostras de sangue humano, e (2) o CellTracks Analyzer II (doravante referido como o instrumento de análise), que analisa estes amostras seguintes preparação. Para distinguir CTC contaminem leucócitos o instrumento de preparação utiliza um anticorpo mediado, separação magnética abordagem baseada em ferrofluido e fluorescência de coloração diferencial. Inicialmente, o sistema de etiquetas CTC, utilizando anticorpos anti-EpCAM conjugados com nanopartículas de ferro. A amostra é então incubada num campo magnético, e todas as células não marcadas são aspirados. Células tumorais seleccionadas são ressuspensos e incubados em um de fluorescência da mancha diferencial, que consiste de anticorpos fluorescentemente marcadas e um reagente de coloração nuclear. Finalmente, a amostra é transferida para um cartucho magnético, chamado um magnest (daqui em diante referido como o dispositivo magnético), e scanned usando o instrumento de análise.

O instrumento de análise é usado para digitalizar amostras preparadas com diferentes filtros de fluorescência, cada um otimizado para a partícula fluorescente apropriado, usando uma lente objetiva de 10X. CTCs são identificadas como células que estão vinculados por anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, e 19), ea mancha nuclear 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Por outro lado, os leucócitos contaminantes são identificadas como células que estão vinculados por anti-CD45-aloficocianina (APC) e DAPI. Após a análise, as células de tumor possíveis definidos por computador são apresentados ao utilizador. A partir dessas imagens, o usuário deve empregar análise qualitativa utilizando os parâmetros definidos e coloração diferencial discutidos acima para determinar quais eventos são CTCs.

Além de fornecer um método padronizado para CTC enumeração, o CSS permite a caracterização molecular de CTCs com base em marcadores de proteínas de interesse. Este interrogatório cum ser efectuada ao nível de uma única célula, utilizando um isotiocianato de fluoresceína (FITC), canal de fluorescência não é necessária para a identificação CTC ^16. Embora esta plataforma proporciona a capacidade para a caracterização molecular, o processo detalhado de desenvolvimento do protocolo e optimização não é bem definida. Três marcadores comercialmente disponíveis foram desenvolvidas pelo fabricante para utilização com o EAP, incluindo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), o crescimento epidérmico humano do receptor do factor 2 (HER2), e factor de crescimento semelhante à insulina-1 receptor (IGF-1R). Análise HER2, em combinação com o CSS, tem sido utilizado por vários grupos para ilustrar o potencial de caracterização CTC para informar a tomada de decisão clínica e mudar potencialmente diretrizes de tratamento existentes. Por exemplo, Fehm et al. ¹⁷ demonstraram que aproximadamente um terço dos pacientes com cancro da mama com tumores HER2-primário tinha HER2 ⁺ CTC. Além disso, Liu et al.18 informou recentemente que até 50% dos pacientes com HER ⁺ câncer de mama metastático HER2 não tinha ⁺ CTCs. Herceptin, um receptor HER2 interferindo anticorpo monoclonal demonstraram beneficiar muito a pacientes cujos tumores expressam níveis suficientes de HER2, é um tratamento vulgarmente utilizado para pacientes com tumores HER2 ⁺ primárias ^19-21. No entanto, esses estudos sugerem que Herceptin pode estar sendo sub-utilizada de forma otimizada e que a caracterização CTC pode ajudar na previsão de resposta ao tratamento. Em última análise, a caracterização CTC pode ter o potencial para melhorar o atendimento personalizado.

Pesquisa CTC é o único que tem em grande parte utilizou uma abordagem de cabeceira-to-de bancada. Este método, ao contrário de bancada-a-cabeceira investigação, que muitas vezes pode levar anos para afetar o atendimento ao paciente, permitiu CTCs entrada rápida no ambiente clínico. No entanto, os médicos hesitam em utilizar os resultados da análise CTC no tratamento do paciente-mak decisãoção, devido a uma falta de compreensão da sua biologia subjacente. Portanto mouse modelos pré-clínicos adequados de técnicas de metástase e análise CTC complementar deve ser utilizado, a fim de investigar essas questões pendentes. Em geral, existem dois tipos de modelos pré-clínicos usados ​​para estudar a cascata metastática, (1) os modelos de metástase espontânea, o que permite o estudo de todos os passos da cascata metastática, e (2) os modelos de metástases experimentais, os quais só permitem o estudo de passos posteriores no processo metastático como extravasamento e a formação do tumor secundário ^22. Modelos de metástase espontâneas, envolvem injeções de células tumorais em locais ortotópico apropriadas (por exemplo, injeção de células de câncer de próstata na próstata para o estudo do câncer de próstata). As células são então dado tempo para formar os tumores primários e metástase espontânea para locais secundários, tais como o osso, pulmão, e nódulos linfáticos. Emcontraste, os modelos de metástase experimentais envolvem injeção direta de células tumorais na corrente sanguínea (por exemplo, via veia da cauda ou injeção intracardíaca às células-alvo para locais específicos) e, portanto, ignorar as etapas iniciais de intravasation e disseminação para os órgãos secundários ^22. Até agora, a maioria das análises CTC em sistemas modelo in vivo tem sido realizada utilizando qualquer ²³ ou adaptados CTC técnicas à base de citometria de base humana (por exemplo, AdnaTest) ^24. Embora útil, nenhuma dessas técnicas reflete adequadamente CTC enumeração usando o padrão ouro CSS. Com base na aprovação clínica, natureza padronizada, e o uso generalizado do CSS, o desenvolvimento de uma técnica de captura e detecção do CTC para modelar in vivo que utiliza a preparação da amostra equivalente, processamento, e critérios de identificação seria vantajoso que os resultados sejam comparáveis ​​àqueles obtido a partir de amostras de doentes. No entanto, devido ao volume de requirements do instrumento de preparação não é possível processar pequenas quantidades de sangue, utilizando esta plataforma automatizada. . Além disso, o trabalho anterior por Eliane et al ²⁵ demonstraram que a contaminação das amostras com células epiteliais do mouse (que também se enquadram na definição CTC padrão [EpCAM ⁺ CK ⁺ DAPI ⁺ CD45 ^-]) pode levar a erros de classificação de rato células epiteliais escamosas como CTCs. Para tratar dessas questões de uma técnica adaptada que permite a utilização dos reagentes CSS CTC combinados com um procedimento de isolamento manual foi desenvolvido. A adição de um antigénio de leucócitos humanos marcados com FITC (HLA) de anticorpos para o doseamento permite que as células de tumor humano a ser distinguido de rato células epiteliais escamosas.

Este manuscrito descreve o padrão, desenvolvido comercialmente e protocolo CSS otimizado para o processamento de amostras de pacientes de sangue e armadilhas comuns que podem ser encontrados, incluindo discrepânciast itens que podem levar a erros de classificação do CTC. Além disso, a personalização do ensaio CSS para examinar as características de proteína definida pelo utilizador de CTC capturados e uma técnica CSS comparável adaptado que permite o enriquecimento e a detecção dos CTC de pequenos volumes de sangue de rato, em modelos pré-clínicos de metástases são descritos.

Protocol

Todos os estudos em humanos descritos neste manuscrito foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa Humana da Universidade Ocidental. Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com as recomendações do Conselho Canadense de Cuidados Animal, no âmbito de protocolos aprovados pela Western University Uso de Animais Subcomissão. 1. Padrão CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes, utilizando o CSS 1. Coleta de sang…

Representative Results

Padrão CTC enumeração Assay A sensibilidade e especificidade do CSS tem sido bem documentada na literatura. No entanto, para validar a recuperação CTC equivalente, cravado (1.000 LNCaP células cancerosas da próstata humana) e amostras de sangue humano não enriquecido de doadores voluntários saudáveis ​​foram processados ​​no CSS usando o protocolo CSSCTC padrão. Como esperado, as amostras não enriquecido estavam livres dos CTC, 0,00 ± 0,00%, e a recuperação do CTC mostrou…

Discussion

Apesar do desenvolvimento de muitas novas tecnologias CTC desde a introdução da CSS em 2004, esta técnica ainda é a única tecnologia clinicamente aprovado hoje no mercado e, portanto, é considerada o padrão ouro atual para a detecção e enumeração CTC. Este manuscrito demonstrou que embora o CSS tem padrões de controle de qualidade rigoroso que pode estar sujeito a viés de interpretação e que a identificação CTC em amostras de pacientes é muito diferente de identificação em amostras enriquecidas. Fora…

Materials

REAGENTS
0.5M EDTA
Anti-human CD44-FITC	BD Pharmigen	555478
Anti-human CD44-PE	BD Pharmigen	555479
Anti-human HLA-AlexaFluor488	BioLegend	311415
Anti-mouse CD45-APC	eBioscience	17-0451-82
Bond Primary Antibody Diluent	Leica	AR9352
CellSave Preservative Tubes	Veridex	952820 (20 pack)                      79100005 (100 pack)
CellSearch CTC Control Kit	Veridex	7900003
CellSearch CTC Kit	Veridex	7900001
CellSearch CXC Control Kit	Veridex	7900018RUO
CellSearch CXC Kit	Veridex	7900017RUO
Instrument Buffer	Veridex	7901003
Streck Cell Preservative (aka CytoChex)	Streck	213350
EQUIPMENT
1 ml syringe
10 ml serological pipette
1000µl pipette
1000µl pipette tips
12 x 75mm flow tubes
200µl gel loading tips
200µl pipette
22 gauge needle
5 3/4" disposible pasteur pipet	VWR	14672-200
5 ml serological pipette
Automated pipettor
Capillary Blood Collection Tube (EDTA)	BD Microtainer	365974
CellSearch Analyzer II	Veridex	9555	Includes magnests and verification cartirdges
CellSearch AutoPrep System	Veridex	9541
Centrifuge
MagCellect Magnet	R&D Systems	MAG997
Small Latex Bulb	VWR	82024-550
Vortex