Helical Organisering av koagulasjonsfaktor VIII på Lipid Nanorør

Summary

Vi beskriver her en kombinasjon av Cryo-elektronmikroskopi, lipid nanoteknologi, og struktur-analyse anvendt for å løse membranbundet struktur av to sterkt homologe FVIII former: humane og porcine. Metodikken er utviklet i vårt laboratorium for å helically organisere de to funksjonelle rekombinante FVIII skjemaer på negativt ladet lipid nanorør (LNT) er beskrevet.

Abstract

Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) ¹ er en kraftig metode for å undersøke den funksjonelle struktur av proteiner og komplekser i en hydratisert tilstand og membranmiljø ^2..

Koagulasjonsfaktor VIII (FVIII) ³ er et multi-domene blodplasma glykoprotein. Defekt eller mangel av FVIII er årsaken for hemofili type A – en alvorlig blødersykdom. Etter proteolytisk aktivering, FVIII bindes til serin protease faktor IXa på den negativt ladede blodplate-membran, som er avgjørende for normal blodpropper ^4.. Til tross for den sentrale rollen FVIII spiller i koagulasjon, er strukturell informasjon for sin membran-bundet tilstand ufullstendig ^fem. Rekombinant faktor VIII-konsentrat er det mest effektivt medikament mot hemofili type A og kommersielt tilgjengelig FVIII kan uttrykkes som humane eller porcine, begge danner funksjonelle komplekser med human Faktor IXa ^6,7.

"> I denne studien presenterer vi en kombinasjon av Cryo-elektron mikroskopi (Cryo-EM), anvendt lipid nanoteknologi og struktur analyse for å løse membran-bundet struktur av to svært homologe FVIII former:. Mennesker og svin Metodikken er utviklet i vårt laboratorium til helisk organisere de to funksjonelle rekombinant FVIII former på negativt ladet lipid nanorør (LNT) er beskrevet. de representative resultater viser at vår tilnærming er tilstrekkelig følsom til å angi forskjeller i den spiralformede organisasjon mellom de to sterkt homologe i sekvens (86% sekvensidentitet ) proteiner. Detaljerte protokoller for den spiralformede organisasjon, Cryo-EM, og elektron-tomografi (ET) datainnsamling er gitt. den to-dimensjonale (2D), og tre-dimensjonale (3D) struktur-analyse anvendt for å oppnå de 3D rekonstruksjoner av human-og porcin FVIII-LNT er diskutert. som presenteres menneskelige og svin FVIII-LNT strukturer viser potensialet av den foreslåtte metoden for å beregnese den funksjonelle, membran-bundet organisering av koagulasjonsfaktor VIII med høy oppløsning.

Introduction

Koagulasjonsfaktor VIII (FVIII) er et stort glykoprotein av 2332 aminosyrer organisert i seks domener: A1-A2-B-A3-C1-C2 ^tre. Ved aktivering av FVIII Trombin virker som kofaktor for faktor IXa i membranbundet Tenase kompleks. Binding av aktivert faktor VIII (FVIIIa) til FIXa i en membran-avhengig måte forbedrer FIXa proteolytisk effektivitet mer enn 10 ^fem ganger, noe som er kritisk for effektiv blodkoagulering ^4.. Til tross for den viktige rollen FVIII spiller i koagulasjon og Tenase kompleks formasjon, er den funksjonell membran-bundet FVIII struktur ennå ikke er løst.

For å løse dette, har enkelt lipidbllag nanorør (LNT) rik på fosfatidylserin (PS), i stand til å binde FVIII med høy affinitet ^{8, 9} og likner den aktiverte blodplater overflaten er utviklet ^10. Fortløpende spiralformede organiseringen av FVIII bundet til LNT har vist seg å være effective for strukturbestemmelse av FVIII membran-bundet tilstand av Cryo-EM ^5. Funksjon LNT er et ideelt system for å studere protein-protein-og protein-membran interaksjoner av helically organiserte membran-assosiert proteiner av Cryo-EM ^{11, 12.} Cryo-EM har den fordel i forhold til tradisjonelle konstruksjonsmetoder som røntgen-krystallografi og NMR, som prøven blir bevart i det nærmest den fysiologiske miljø (buffer, membran, pH), uten tilsetningsstoffer og isotoper. I tilfelle av FVIII, studere membranbundet struktur med denne teknikk er enda mer fysiologisk relevant, da den LNT likne av størrelse, form og sammensetning av pseudopodia av de aktiverte blodplater, hvor de Tenase komplekser montere in vivo.

Defekter og mangel av FVIII årsaken hemofili A, en alvorlig blødning lidelse som påvirker en i 5000 hanner av den menneskelige befolkning ^{4, 6.} Den mest effective terapi for hemofili A er livslang behandling med rekombinant human FVIII (hFVIII). En betydelig komplikasjon av det rekombinante faktor VIII Hemophilia A terapi er utviklingen av inhibitoriske antistoffer mot human formen som påvirker omtrent 30% av hemofili A-pasienter ^13. I dette tilfellet, er svin FVIII (pFVIII) konsentrat brukes, som svin FVIII skjermer med lav kryssreaksjon med hemmende antistoffer mot human FVIII og skjemaer funksjonelle komplekser med humant FIXa ^7. Er viktig å etablere en membranbundet organisering av både svin og menneske FVIII skjemaer for å forstå den strukturelle grunnlaget for FVIII kofaktor funksjon og implikasjoner for blod hemostase.

I denne studien, beskriver vi en kombinasjon av lipid nanoteknologi, Cryo-EM, og struktur analyse laget for å løse membranbundne organisering av to svært homologe FVIII former. De presenterte Cryo-EM data og 3D-strukturer for helically organisert porcine og menneskelig faktor VIII på negativt ladet LNT viser potensialet av den foreslåtte nanoteknologi som grunnlag for strukturbestemmelse av FVIII og membranbundne koagulasjonsfaktorer og komplekser i en fysiologisk membran miljø.

Protocol

En. Prøvepreparering Buffer utveksling human faktor VIII-BDD 14 og porcine FVIII-BDD 15 mot HBS-Ca-buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH = 7,4) og konsentrer til 1,2 mg / ml. Hold proteinløsningen ved -80 ° C. Forbered lipid nanorør (LNT) ved å blande GalactosylCeramide (GC) og fosfatidylserin (PS) på 01:04 w / w forholdet i kloroform. Fordamp kloroformen under argon og oppløse lipidene i HBS-buffer til 1 mg / ml. Hold LNT løsning ved 4 ° C. </li…

Representative Results

Rekombinant human-og svin FVIII ble med hell arrangert i skruelinjeform på negativt ladede enkelt bilags LNT, likner den aktiverte blodplateoverflaten. Spiral organisering av human-og porcin faktor VIII-LNT var konsistent gjennom de innsamlede digitale mikrografer (figur 2). Kontrollen LNT og den menneskelige og svin FVIII-LNT spiralformede rør ble valgt og segmentert med e2helixboxer.py GUI og innledende datasett som er opprettet med e2workflow.py GUI, Single partikkel alternativ <st…

Discussion

I dette arbeidet er presentert en metode for å skille mellom to membranbundne organisasjoner av svært homologe proteiner human-og porcin faktor VIII selv montert på lipid nanorør i de forhold som var tilstede i den menneskelige kroppen.

I den beskrevne fremgangsmåten, blir human-og porcin faktor VIII med hell arrangert i spiralform på lipid nanorør, som er det mest kritiske trinn. Den neste kritiske trinnet er å bevare prøven i tynn amorfe isen ved flash …

Materials

JEM2100 with LaB6	JEOL Ltd.	JEM-2100	operated at 200 kV
with TEMCON software	JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder	Gatan, Inc.	626.DH	cooled to -175 °C
with temperature controler unit	Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera	Gatan, Inc.	US4000	4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner	Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV	FEI
Materials
Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid	Ted Pella	01821	plasma cleaned for 10 s on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh	Electron Microscopy Sciences	Q225-CR2	Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes
Uranyl acetate dihydrate	Ted Pella	19481	1% solution, filtered
Galactosyl ceramide	Avanti Polar Lipids Inc.	860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids Inc.	840035
Software
EM software Digital Micrograph	Gatan, Inc.		http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN	free download		http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/
EM software Spider	free download		http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR	free download		Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD)	free download		http://bio3d.colorado.edu/imod/
EM software (SerialEM)	free download		ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera	free download		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html