लिपिड नैनोट्यूब पर रक्त जमावट फैक्टर आठवीं की पेचदार संगठन
Summary
मानव और सुअर: हम दो अत्यधिक मुताबिक़ FVIII रूपों की झिल्ली ही सीमित संरचना को हल करने के लिए लागू किया क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, लिपिड नैनो, और संरचना विश्लेषण का एक संयोजन प्रस्तुत करते हैं. कुंडलित नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड नैनोट्यूब (LNT) पर दो कार्यात्मक पुनः संयोजक FVIII रूपों को व्यवस्थित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में विकसित की कार्यप्रणाली में वर्णित है.
Abstract
क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) 1 एक हाइड्रेटेड राज्य और झिल्ली पर्यावरण 2 में प्रोटीन और परिसरों के कार्यात्मक संरचना की जांच के लिए एक शक्तिशाली तरीका है.
जमावट फैक्टर आठवीं (FVIII) 3 एक बहु – डोमेन रक्त प्लाज्मा ग्लाइकोप्रोटीन है. एक गंभीर खून बह रहा विकार – दोष या FVIII की कमी हीमोफिलिया एक प्रकार का कारण है. Proteolytic सक्रियण पर, FVIII सामान्य रक्त के थक्के 4 के लिए महत्वपूर्ण है जो नकारात्मक आरोप लगाया प्लेटलेट झिल्ली, पर सेरीन प्रोटीज फैक्टर IXa को बांधता है. FVIII जमावट में खेलता निर्णायक भूमिका होने के बावजूद इसकी झिल्ली ही सीमित राज्य के लिए संरचनात्मक जानकारी अधूरी 5 है. संयोजक FVIII ध्यान केंद्रित हीमोफिलिया ग्रुप ए के खिलाफ सबसे प्रभावी दवा है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध FVIII मानव या सुअर, मानव फैक्टर IXa 6,7 के साथ दोनों के गठन कार्यात्मक परिसरों के रूप में व्यक्त किया जा सकता है.
"> इस अध्ययन में हम क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) का एक संयोजन पेश, लिपिड नैनो और संरचना विश्लेषण दो अत्यधिक मुताबिक़ FVIII रूपों की झिल्ली ही सीमित संरचना को हल करने के लिए आवेदन किया. मानव और सुअर हमारी प्रयोगशाला में विकसित की कार्यप्रणाली कुंडलित नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड नैनोट्यूब (LNT) पर दो कार्यात्मक पुनः संयोजक FVIII रूपों को संगठित करने का वर्णन किया गया है. प्रतिनिधि परिणाम हमारे दृष्टिकोण अनुक्रम में अत्यधिक मुताबिक़ दो (86% अनुक्रम पहचान के बीच पेचदार संगठन में मतभेद को परिभाषित करने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है कि दिखाना ) प्रोटीन. पेचदार संगठन, क्रायो EM और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (ईटी) डाटा अधिग्रहण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल. दो आयामी (2 डी दिया) और तीन आयामी (3 डी) संरचना विश्लेषण मानव और सुअर के 3D पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए आवेदन कर रहे हैं FVIII-LNT चर्चा की है. प्रस्तुत मानव और सुअर का FVIII-LNT संरचनाओं प्रस्तावित पद्धति का संभावित calculat को दिखानेउच्च संकल्प में रक्त जमावट फैक्टर आठवीं की ई कार्यात्मक, झिल्ली ही सीमित संगठन.Introduction
रक्त जमावट फैक्टर आठवीं (FVIII) छह डोमेन में संगठित 2,332 अमीनो एसिड की एक बड़ी ग्लाइकोप्रोटीन है: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. थ्रोम्बिन सक्रियण FVIII झिल्ली ही सीमित Tenase परिसर के भीतर फैक्टर IXa को cofactor के रूप में कार्य करता है पर. एक झिल्ली के आधार ढंग से FIXa को सक्रिय FVIII (FVIIIa) की बाइंडिंग FIXa प्रोटियोलिटिक दक्षता कुशल रक्त जमावट 4 के लिए महत्वपूर्ण है जो 10 से अधिक 5 बार, बढ़ाता है. FVIII जमावट और Tenase जटिल गठन में खेलता महत्वपूर्ण भूमिका होने के बावजूद कार्यात्मक झिल्ली ही सीमित FVIII संरचना हल किया जाना अभी बाकी है.
इस पते, उच्च आत्मीयता 8, 9 के साथ FVIII बाध्यकारी और सक्रिय प्लेटलेट सतह दिखने में सक्षम Phosphatidylserine (पी एस) में अमीर एकल लिपिड bilayer नैनोट्यूब (LNT), 10 विकसित किया गया है. LNT करने के लिए बाध्य FVIII की लगातार पेचदार संगठन प्रभावकारिता होना सिद्ध किया गया हैक्रायो ईएम 5 से FVIII झिल्ली ही सीमित राज्य की संरचना निर्धारण के लिए किया है. Functionalized LNT क्रायो ईएम 11, 12 से प्रोटीन, प्रोटीन और घुमावदार ढंग से संगठित झिल्ली जुड़े प्रोटीन का प्रोटीन झिल्ली बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श व्यवस्था कर रहे हैं. नमूना मनोवैज्ञानिक वातावरण (बफर, झिल्ली, पीएच) में निकटतम में संरक्षित है के रूप में क्रायो ईएम additives और आइसोटोप के बिना, इस तरह के एक्स – रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर के रूप में पारंपरिक संरचनात्मक तरीकों से अधिक लाभ है. LNT आकार, आकृति और रचना Tenase परिसरों विवो में इकट्ठा जहां सक्रिय प्लेटलेट्स की pseudopodia द्वारा बारीकी से मेल खाता रूप FVIII के मामले में, इस तकनीक के साथ झिल्ली ही सीमित संरचना का अध्ययन, और भी अधिक physiologically प्रासंगिक है.
दोष और FVIII कारण हीमोफिलिया ए, मानव आबादी 4, 6 की 1 5000 में पुरुषों को प्रभावित एक गंभीर खून बह रहा विकार की कमी. अधिकांश ईहीमोफिलिया के लिए ffective चिकित्सा पुनः संयोजक मानव FVIII (hFVIII) के जीवन भर प्रशासन है. पुनः संयोजक FVIII हीमोफिलिया एक चिकित्सा का एक महत्वपूर्ण जटिलता हीमोफिलिया के रोगियों 13 के लगभग 30% को प्रभावित मानव प्रपत्र को निरोधात्मक एंटीबॉडी का विकास है. इस मामले में, सुअर का FVIII (pFVIII) ध्यान केंद्रित मानव FVIII और मानव FIXa 7 के साथ रूपों कार्यात्मक परिसरों के खिलाफ निरोधात्मक एंटीबॉडी के साथ सुअर का FVIII प्रदर्शित करता है कम पार जेट के रूप में प्रयोग किया जाता है. सुअर और मानव FVIII रूपों दोनों की झिल्ली ही सीमित संगठन की स्थापना FVIII cofactor समारोह और रक्त रक्तस्तम्भन के लिए निहितार्थ के संरचनात्मक आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है.
इस अध्ययन में, हम लिपिड नैनो, क्रायो-EM, और दो अत्यधिक मुताबिक़ FVIII रूपों की झिल्ली ही सीमित संगठन को हल करने के लिए डिज़ाइन संरचना विश्लेषण का एक संयोजन का वर्णन. कुंडलित आयोजन porci के लिए प्रस्तुत क्रायो-EM डेटा और 3 डी संरचनाओंनकारात्मक आरोप लगाया LNT पर पूर्वोत्तर और मानव FVIII FVIII की संरचना निर्धारण और झिल्ली ही सीमित जमावट कारकों और एक शारीरिक झिल्ली वातावरण में परिसरों के लिए आधार के रूप में प्रस्तावित नैनो की क्षमता दिखा.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में एक पद्धति अत्यधिक मुताबिक़ प्रोटीन के दो झिल्ली ही सीमित संगठनों के बीच अंतर करने के लिए प्रस्तुत किया है: मानव और सुअर का FVIII आत्म इकट्ठे मानव शरीर में सामना करना पड़ा स्थितियों में लिपिड नैन…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
10SDG3500034 और UTMB-एनसीबी एसएसएम के लिए धन शुरू: इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से एक राष्ट्रीय वैज्ञानिक विकास अनुदान द्वारा समर्थित है. लेखकों सीली UTMB में स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के लिए केंद्र (कम से क्रायो EM और वैज्ञानिक कंप्यूटिंग सुविधाओं को स्वीकार करते हैं www.scsb.utmb.edu ), साथ ही डीआरएस. 2 डी और 3 डी पेचदार पुनर्निर्माण एल्गोरिदम के साथ मदद के लिए स्टीव Ludtke और एड Egelman.
Materials
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Materials | |||
| Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 s on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| Software | |||
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
References
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