Helical Organisation av koagulationsfaktor VIII på Lipid Nanorör
Summary
Vi presenterar en kombination av Cryo-elektronmikroskopi, lipid nanoteknik, och strukturanalys tillämpas för att lösa membranbundna strukturen av två mycket homologa FVIII former: mänskliga och svin. Den metod som utvecklats i vårt laboratorium för att spiral organisera de två funktionella rekombinanta FVIII formulär på negativt laddade lipid nanorör (LNT) beskrivs.
Abstract
Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) 1 är en kraftfull metod för att undersöka den funktionella strukturen hos proteiner och komplex i ett hydratiserat tillstånd och membranmiljö 2.
Koagulationsfaktor VIII (FVIII) 3 är en multi-domän blodplasma glykoprotein. Defekt eller brist på faktor VIII är orsaken för hemofili typ A – en allvarlig blödning sjukdom. Efter proteolytisk aktivering, binds FVIII till serinproteaset faktor IXa på den negativt laddade plättmembranet, som är kritisk för normal blodkoagulation 4. Trots den centrala roll FVIII spelar i koagulation, är strukturinformation för dess membranbundna tillstånd ofullständig 5. Rekombinant FVIII-koncentrat är det mest effektiva läkemedel mot hemofili typ A och kommersiellt tillgänglig FVIII kan uttryckas såsom human eller porcin, båda som bildar funktionella komplex med human Faktor IXa 6,7.
"> I denna studie presenterar vi en kombination av Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), appliceras lipid nanoteknologi och strukturanalys för att lösa membranbunden struktur av två starkt homologa FVIII former:. Human och porcin Den metod som utvecklats i vårt laboratorium att spiral organisera de två funktionella rekombinanta FVIII formulär på negativt laddade lipid nanorör (LNT) beskrivs. De representativa resultat visar att vår strategi är tillräckligt känslig för att definiera skillnaderna i den spiralformade organisationen mellan de två mycket homolog i sekvens (86% sekvensidentitet ) proteiner. Detaljerade protokoll för spiral organisation, Cryo-EM och elektron tomografi (ET) datainsamling ges. Den tvådimensionella (2D) och tredimensionella (3D) struktur analys tillämpas för att erhålla de 3D-rekonstruktioner av människa och svin FVIII-LNT diskuteras. De presenterade humana och svin FVIII-LNT strukturer visar potentialen i den föreslagna metoden för beräkninge den funktionella, membranbunden organisationen av koagulationsfaktor VIII med hög upplösning.Introduction
Koagulationsfaktor VIII (FVIII) är ett stort glykoprotein av 2332 aminosyror är organiserade i sex områden: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Upon Trombinaktive FVIII fungerar som kofaktor till faktor IXa i den membranbundna Tenase komplex. Bindning av aktiverad faktor VIII (FVIIIa) till FIXa i ett membran-beroende sätt förbättrar FIXa proteolytiska effektiviteten mer än 10 5 gånger, vilket är avgörande för en effektiv blodkoagulering 4. Trots den viktiga roll FVIII spelar i koagulation och Tenase komplexbildning, är det funktionellt membranbundna FVIII struktur ännu inte har lösts.
För att åtgärda detta, har enstaka lipiddubbelskikts nanorör (LNT) rika på fosfatidylserin (PS), som kan binda FVIII med hög affinitet 8, 9 och liknar ytan aktiverade trombocyter utvecklats 10. Löpande spiral organisation av FVIII bundet till LNT har visat sig vara effective för strukturbestämning av FVIII membranbundet tillstånd av Cryo-EM 5. Funktionaliserad LNT är ett idealiskt system för att studera protein-protein och protein-membran interaktioner av spiralformigt organiserade membranassocierade proteiner genom Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM har den fördelen framför traditionella strukturella metoder såsom röntgenkristallografi och NMR, som provet är bevarad vid närmast den fysiologiska miljön (buffert, membran, pH), utan tillsatser och isotoper. I fallet med FVIII, studera membranbundna strukturen med denna teknik är ännu mer fysiologiskt relevant, eftersom LNT liknar tätt efter storlek, form och sammansättning av pseudopodia av de aktiverade trombocyterna där Tenase komplex samlas in vivo.
Fel och brist på FVIII orsakar Hemofili A, en allvarlig blödning sjukdom som påverkar 1 i 5.000 män i den mänskliga befolkningen 4, 6. Den mest effective terapi för hemofili A är livslång behandling med rekombinant human faktor VIII (hFVIII). En betydande komplikation av den rekombinanta FVIII Hemofili A-behandling är utvecklingen av hämmande antikroppar mot den mänskliga formen som drabbar ungefär 30% av hemofili A-patienter, 13. I detta fall är porcin FVIII (pFVIII) koncentrat används, såsom porcina FVIII displayer låg korsreaktivitet med hämmande antikroppar mot human faktor VIII och bildar funktionella komplex med humant FIXa 7. Inrättande av membranbundna organisation av både svin och mänskliga FVIII former är viktigt att förstå den strukturella grunden för FVIII kofaktor funktion och konsekvenser för blod hemostas.
I denna studie beskriver vi en kombination av lipid nanoteknik, Cryo-EM, och strukturanalys som syftar till att lösa membranbundna organisation av två mycket homologa FVIII former. De presenterade Cryo-EM data och 3D-strukturer för spiral organiserad Porcine och mänsklig FVIII på negativt laddade LNT visar potentialen i den föreslagna nanoteknik som bas för strukturbestämning av FVIII och membranbundna koagulationsfaktorer och komplex i en fysiologisk membranmiljö.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete en metod presenteras för att skilja mellan två membranbundna organisationer av mycket homologa proteiner: mänskliga och svin FVIII själv monterade på lipid nanotuber i villkoren som uppstått i den mänskliga kroppen.
I det beskrivna förfarandet, är mänsklig och svin FVIII framgångsrikt organiserat spiral på lipid nanorör, som är det mest kritiska steget. Nästa viktiga steg är att bevara provet i tunn amorf is genom snabb frysning på …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ett bidrag från American Heart Association National Scientist utveckling: 10SDG3500034 och UTMB-NCB starta fonder till SSM. Författarna erkänner de Cryo-EM och beräkningsvetenskap faciliteter på Sealy Centrum för strukturbiologi vid UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), samt Dr. Steve Ludtke och Ed Egelman om hjälp med 2D-och 3D spiralrekonstruktionsalgoritmer.
Materials
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Materials | |||
| Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 s on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| Software | |||
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
References
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
- Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
- Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
- Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
- Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. , (2013).
- Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
- Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
- Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
- Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
- Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
- Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
- Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII–a clinician’s experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
- Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
- Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
- Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).
