इस प्रोटोकॉल में विवो सीएनएस नमूनों की translatome अध्ययन करने के क्रम में polyribosome विभाजन की आवश्यक संशोधनों को दिखाता है. यह अलगाव और बाध्य शाही सेना भिन्न राइबोसोम के लिए कुल शाही सेना की तुलना के माध्यम से अनुवाद और प्रतिलेखन विनियमन के वैश्विक मूल्यांकन की अनुमति देता है.
कई प्रक्रियाओं mRNAs और प्रोटीन की ट्रांसक्रिप्शन, अनुवाद और स्थिरता सहित जीन अभिव्यक्ति में शामिल रहे हैं. इन कदमों से प्रत्येक कसकर प्रोटीन बहुतायत के अंतिम गतिशीलता को प्रभावित करने, विनियमित रहे हैं. विभिन्न नियामक तंत्र अकेले जीन की अभिव्यक्ति का एक अविश्वसनीय सूचक mRNA स्तर प्रतिपादन, अनुवाद कदम पर मौजूद हैं. इसके अलावा, mRNA अनुवाद के स्थानीय विनियमन विशेष रूप से तंत्रिका जीव विज्ञान में ध्यान का ध्यान केंद्रित करने के लिए 'translatomics' स्थानांतरण, neuronal कार्यों में फंसाया गया है. प्रस्तुत विधि पुल transcriptomics और प्रोटिओमिक्स के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
यहाँ हम कई राइबोसोम के लिए सक्रिय रूप से अनुवादित mRNAs का संघ और सुक्रोज ढ़ाल में उनके अंतर अवसादन पर आधारित translatome पूछताछ जो polyribosome विभाजन की तकनीक, के लिए आवश्यक संशोधनों का वर्णन है. परंपरागत रूप से, विशेष रूप से Centra के vivo नमूनों के साथ काम करनाएल तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), कारण सामग्री के प्रतिबंधित मात्रा और वसा ऊतकों के घटकों की उपस्थिति के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है. एक माउस रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क के उपयोग के द्वारा प्रदर्शन के रूप में यह पता करने के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से, सीएनएस सामग्री के कम से कम राशि के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित है. संक्षेप में, सीएनएस ऊतकों निकाले जाते हैं और अनुवाद के राइबोसोम cycloheximide साथ mRNAs पर स्थिर रहे. माइलिन प्लवनशीलता तो लिपिड अमीर घटकों को दूर करने के लिए किया जाता है. Fractionation mRNAs उनके ribosomal लदान के अनुसार अलग हो रहे हैं, जहां एक sucrose ढाल पर किया जाता है. पृथक भिन्न नया जीनोम चौड़ा परख प्रौद्योगिकियों सहित डाउनस्ट्रीम assays, की एक श्रृंखला के लिए उपयुक्त हैं.
जीन अभिव्यक्ति अनुवाद सबसे प्रमुख प्रभाव 1 असर के साथ, प्रतिलेखन, अनुवाद और mRNA और प्रोटीन की स्थिरता की संयुक्त कार्रवाई से निर्धारित होता है. यह इन चरणों में से प्रत्येक उच्च विनियमित है कि अब स्पष्ट है. माइक्रो RNAs, आरएनए कणिकाओं, विकल्प और cytoplasmic polyadenylation के गठन जीन अभिव्यक्ति 2,3 के बाद transcriptional विनियमन के कुछ उदाहरण हैं. इन तंत्रों में से प्रत्येक अनुवाद से प्रतिलेखन uncouples और ब्याज की जैविक प्रणाली में proteome को प्रभावित करती है. इस प्रकार, हैरानगी, अकेले mRNA स्तर प्रोटीन का स्तर 4 का एक अपूर्ण readout हैं. मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स हालांकि हाल के अग्रिमों के बावजूद, संवेदनशीलता और प्रोटीन अनुक्रम के प्रस्ताव पर काफी सीमाओं वहाँ अब भी कर रहे हैं, जीन अभिव्यक्ति का सबसे सीधा मूल्यांकन प्रदान करता है. इसलिए translatome को संबोधित करते हुए का अनुवाद mRNAs का प्रदर्शनों की सूची, पढ़ाई के बीच एक उत्कृष्ट समझौता प्रदान करता हैtranscriptome और proteome. यह अंतिम जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने में transcriptomics तुलना में ज्यादा सटीक है, और उच्च कवरेज और प्रोटिओमिक्स से अनुक्रम संकल्प दोनों प्रदान करता है.
स्तनधारी प्रणालियों में, अनुवाद की घटनाओं का बहुमत टोपी पर निर्भर दीक्षा के माध्यम से शुरू करते हैं. एक साथ 40 छोटे ribosomal सबयूनिट साथ यूकेरियोटिक दीक्षा कारकों के एक समूह ने एक mRNA की 5 'टोपी पर इकट्ठा. जटिल तो mRNA को स्कैन करता है और अगस्त कोडोन शुरू पहुंचने पर, एक पूरा 80S राइबोसोम के लिए फार्म 60 बड़े ribosomal सबयूनिट रंगरूटों. बढ़ाव चरण राइबोसोम बढ़ाव कारकों नवजात पेप्टाइड श्रृंखला के लिए भरी हुई tRNAs से अमीनो एसिड के समावेश की सहायता के साथ, mRNA के साथ आगे बढ़ के साथ आय. एकाधिक राइबोसोम एक साथ एक एकल mRNA साथ आगे बढ़ सकते हैं और एसोसिएटेड राइबोसोम की संख्या प्रोटीन संश्लेषण 5,6 की दर के साथ सहसंबंधी दिखाया गया है. इस ribosomal लोड हो रहा है ट्रॅन के लिए एक विश्वसनीय संकेत बनाता हैslation और सक्रिय रूप से अवसादन दर के आधार पर mRNAs अनुवाद की जुदाई की अनुमति देता है. MRNAs अनुवाद की मात्रा का ठहराव के अलावा, अनुक्रम जानकारी अनुवाद विनियमन में शामिल रूपांकनों की पहचान करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा बंधनकारी प्रोटीन और अन्य अनुवाद कारकों संबंधित विनियामक प्रोटीन का अध्ययन और खोज की सुविधा, विभिन्न भागों से अलग किया जा सकता आरएनए.
तंत्रिका तंत्र में, translational नियंत्रण ऐसे mRNA भंडारण, परिवहन और स्थानीय प्रोटीन संश्लेषण के रूप में प्रक्रियाओं से जोड़ा गया है. विकास शंकु अक्षतंतु 7 के बाकी हिस्सों से अलग mRNAs का एक विशिष्ट स्थानीयकृत पूल बंदरगाह दिखाया गया है. इसके अलावा, axons स्थानीय रूप से प्रोटीन 8,9 synthesize करने की क्षमता होती है. नतीजतन, अनुवाद के स्थानीय नियंत्रण तंत्रिका जीव विज्ञान में अध्ययन का एक महत्वपूर्ण विषय बन गया है. यह पता करने के polyribosome विभाजन के संभावित तकनीक के लिए इस्तेमाल किया गया था, जिसमें कई अध्ययनों में सचित्र किया गया हैरीढ़ की हड्डी के विकास में अक्षतंतु मार्गदर्शन की जांच, और मस्तिष्क 10,11 में BDNF की गतिविधि पर निर्भर अनुवाद का प्रदर्शन किया.
Polyribosome fractionation एक उपन्यास तकनीक नहीं है, यह एक विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनी हुई है. इनपुट सामग्री के आधार पर पर्याप्त अनुकूलन आवश्यक हो सकता है. यह विशेष रूप से सामग्री की राशि अक्सर ऊतक घटकों का अनुवाद mRNAs का अलगाव बाधा एक सीमा और वसायुक्त है जहां vivo में सीएनएस के नमूने, के लिए मामला है. अधिकांश प्रकाशित fractionation प्रोटोकॉल खमीर या स्तनधारी सेल लाइनों के साथ सौदा है, और मस्तिष्क 12,13,14 के लिए स्थापित प्रोटोकॉल रहे हैं. इसके विपरीत, रीढ़ की हड्डी डोरियों के विभाजन का वर्णन किसी भी प्रकाशन मुश्किल से कर रहे हैं, और पिछले प्रोटोकॉल 15 जमा होने के लिए पशुओं की एक बड़ी संख्या से रीढ़ की हड्डी की आवश्यकता होती है. इन कारणों के लिए, कई आवश्यक संशोधनों के एकल माउस रीढ़ की हड्डी सहित सीएनएस ऊतकों, के लिए fractionation प्रोटोकॉल अनुकूलन करने के लिए किए गए थे. Cycloheximide साथ राइबोसोम स्थिरीकरण ड्यूरिन राइबोसोम की हदबंदी से बचने के लिए पशु छिड़काव के दौरान किया जाता हैऊतक निष्कर्षण के छ लंबी प्रक्रिया. बाद में, polysomal RNAs polyribosome उपज को अधिकतम करने के लिए एक विशेष तरीके से निकाले जाते हैं. सबसे पहले, douncing से ऊतक के homogenization नियंत्रित बरकरार नाभिक रहता है और डीएनए संक्रमण से बचाता है. नाभिक तो centrifugation द्वारा मज़बूती से निकाल दिया जाता है. डिटर्जेंट एनपी 40 और सोडियम deoxycholate के संयोजन जालिका और इसकी झिल्ली जुड़े राइबोसोम की रिहाई के lysis सुनिश्चित करता है. इसके अलावा, लिपिड अमीर माइलिन के भीतर यूवी अवशोषित घटकों polyribosome प्रोफाइल के अस्पष्ट. ऐसे polyribosomes के रूप में घने यौगिकों pelleted और ऐसे माइलिन नाव के रूप में हल्का यौगिकों और 16 को हटा रहे हैं, जहां माइलिन प्लवनशीलता, इसलिए आवश्यक है. Polyribosomes तो एक 17.5% से 50% sucrose ढाल से अधिक sedimented रहे हैं. इसके बजाय स्वयं प्रत्येक सुक्रोज परत लेयरिंग और ठंड की, ढ़ाल भी एक ढाल मिक्सर का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है. अम्लीय फिनोल / क्लोरोफॉर्म का उपयोग भागों से शाही सेना की निकासी की अनुमति देता है विकासएनए न्यूनतम शाही सेना के नुकसान के साथ हटाया जा सके. हालांकि, चरण उलटा (अंश 16 से ऊपर) घने सुक्रोज अंशों पर हो सकता है.
इस प्रोटोकॉल अनुवाद का स्तर पता है कि अन्य पारंपरिक तरीकों से अधिक लाभ प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, phosphorylated S6 (एक प्रमुख अनुवाद मार्कर) की माप के साथ ही radioisotopes के साथ नवजात चेन की लेबलिंग दोनों वैश्विक अनुवाद के स्तर के बारे में जानकारी दे, लेकिन विशेष रूप से अनुवाद किया जा रहा है पर थोड़ा पता चलता है. Polyribosome विभाजन, दूसरे हाथ पर, मूल्यांकन वैश्विक अनुवाद के लिए न केवल, लेकिन यह भी अनुवाद के mRNAs और संबंधित नियामक प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर चयनित mRNAs के बाहर एक त्वरित पढ़ने के लिए अलग RNAs पर प्रदर्शन किया जा सकता है, और प्रोटीन और अगली पीढ़ी शाही सेना अनुक्रमण जीनोम विस्तृत अध्ययन के लिए किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत अनुकूलन इसलिए कम, तकनीक सीएनएस ऊतकों की न्यूनतम मात्रा के साथ इस्तेमाल किया जा करने की अनुमतिजरूरत जानवरों की संख्या आईएनजी और ऊतक प्रसंस्करण समय को कम करके समग्र प्रयोगात्मक गुणवत्ता में सुधार. दूसरी ओर, इस तकनीक का अनुवाद करने वाले से ठप राइबोसोम भेद नहीं कर सकते. ठप राइबोसोम ले जाने देखिए भारी अंशों में तलछट जाएगा, और डेटा की व्याख्या करते समय इस बात को ध्यान में रखा जाना चाहिए.
राइबोसोम एक सेल प्रकार विशिष्ट ढंग से क्रमश मिलान टैग या पत्रकारों के साथ लेबल और immunoprecipitation 17,18 से अलग mRNAs जुड़े रहे हैं, जिनमें हाल की सूचना तकनीक, अर्थात् RiboTaq और जाल, कर रहे हैं. इस तकनीक को विशेष सेल आबादी के लिए बाहर पढ़ने के उच्च संकल्प की पेशकश करने के लिए विभाजन polyribosome के लिए युग्मित किया जा सकता है. राइबोसोम फुट मुद्रण राइबोसोम द्वारा संरक्षित हैं कि mRNAs का एक और उपन्यास छोटे टुकड़े उत्पन्न करने के लिए nuclease पाचन शामिल है कि तकनीक, या "पैरों के निशान" है. पुस्तकालय तो इन पैरों के निशान से उत्पन्न और अनुक्रम रहे हैं. इस विधि Provअनुवाद पर एक कोडोन विशिष्ट पूरे जीनोम विश्लेषण इडस और ठप राइबोसोम की पहचान करने में सक्षम है, गैर-Aug codons और polyribosome fractionation 19 द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है, जो छोटी नदी के ऊपर खुला पढ़ने फ्रेम, शुरू करते हैं. हालांकि, polyribosome विभाजन इस प्रकार उच्च नमूना पवित्रता अक्सर आवश्यक है जिसमें पुस्तकालय तैयारी के लिए आवश्यक आणविक प्रजातियों के लिए समृद्ध, एकल राइबोसोम युक्त पचा टुकड़े के अलगाव के लिए राइबोसोम की रूपरेखा के लिए युग्मित किया जा सकता है. साथ में ले ली, polyribosome fractionation स्थायी महत्व के साथ एक लचीला तरीका है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तरह जीनोम चौड़ा assays सहित विभिन्न बहाव के अनुप्रयोगों के लिए युग्मित किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम शिक्षा और अनुसंधान के जर्मन संघीय मंत्रालय (BMBF), (सिस्टम्स बायोलॉजी पर Helmholtz एलायंस) कैंसर में संकेत के सिस्टम्स बायोलॉजी और जर्मन कैंसर रिसर्च सेंटर (DKFZ) द्वारा समर्थित किया गया.
Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm | Beckman Coulter | 331374 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
Equipment | |||
Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml | Wheaton | 357538/357542 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |