Der Nachweis eines multiresistenten<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Verstärkung Microarray
Summary
Ein Verstärkungsmikroarray kombiniert asymmetrischen PCR-Amplifikation und Mikroarray-Hybridisierung in einer einzigen Kammer, die Mikroarray-Arbeitsprozess deutlich vereinfacht für den Endbenutzer. Vereinfachung der Microarray-Workflow ist ein notwendiger erster Schritt für die Erstellung von Microarray-basierte Diagnostik, die routinemäßig in der unteren-Ressource-Umgebungen eingesetzt werden kann.
Abstract
Vereinfachung der Microarray-Workflow ist ein notwendiger erster Schritt für die Erstellung von MDR-TB-Microarray-basierte Diagnostik, die routinemäßig in der unteren-Ressource-Umgebungen eingesetzt werden kann. Ein Verstärkungsmicroarray kombiniert asymmetrische PCR-Amplifikation Zielgrößenauswahl, Zielkennzeichnung, und Microarray-Hybridisierung in einer einzigen Lösung und in einem einzigen mikrofluidischen Kammer. Eine Batch-Verarbeitungsverfahren ist mit einem 9-plex asymmetrische Master-Mix und Low-Density-Gel Element Microarray zur Genotypisierung multiresistenter Mycobacterium-Tuberkulose (MDR-TB) demonstriert. Das hier beschriebene Protokoll kann in 6 Stunden abgeschlossen sein und korrekte Genotypisierung mit mindestens 1000 Zelläquivalente von genomischer DNA. Mit On-Chip Waschschritten durchführbar ist, die in einer völlig geschlossenen Amplikon Verfahren und System führt. Das Ausmaß der mit einer Multiplex-Amplifikation Mikroarray wird schließlich durch die Anzahl der Primerpaare, die in einem einzigen Master-m kombiniert werden können, eingeschränktix und trotzdem die gewünschte Empfindlichkeit und Spezifität Leistungsmetriken, anstatt die Anzahl von Sonden, die auf dem Array immobilisiert sind. Ebenso kann die Gesamtanalysezeit verkürzt oder verlängert werden, je nach dem speziellen Verwendungszweck Fragestellung und gewünschte Nachweisgrenze. Dennoch ist die allgemeine Vorgehensweise deutlich Microarray-Workflow optimiert für den Endanwender, indem die Anzahl der manuell intensive und zeitaufwendige Verarbeitungsschritte und bietet eine vereinfachte biochemischen und Mikrofluidik-Pfad für die Übersetzung von Microarray-basierte Diagnostik in der klinischen Routine.
Introduction
Frühe Erkennung und Fall schnelle Behandlung gelten als die wirksamsten Kontrollstrategien zur Mycobacterium tuberculosis (MTB) Getriebe 1 zu reduzieren, und es gibt jetzt einen breiten Konsens in der TB-Community, die ein Point of Care (POC) oder in der Nähe von POC-Test, um gleichzeitig zu diagnostizieren TB und Arzneimittelresistenz (DR) benötigt. Technologien wie Cepheid Genexpert und andere Nukleinsäure-Amplifikation Tests reduzieren die Zeit bis zur Diagnose für viele TB-Patienten und bieten eine schnelle Auslesen der angibt, Resistenz gegen Rifampicin oder ausgewählte Mutationen eine Resistenz gegen andere erste oder zweite Linie 2 Drogen. Obwohl Echtzeit-und isothermen Nucleinsäureamplifikation Tests sind für die Medikamentenresistenz Mutationen, die zu MDR-TB führen, zu identifizieren, ist das Spektrum der Mutationen erkennen sie oft nicht ausreichend, um eine individuelle medikamentöse Behandlung, die der Arzneimittel-Resistenz-Profil des Patienten zu gestalten, und technische Zwänge im Zusammenhangum optisches Übersprechen oder die Komplexität der chemischen Verstärkung und Berichts Mai 3-7 die Anzahl der Loci oder Mutationen, die erfasst werden, zu begrenzen. So sind Detektionstechnologien mit höherer Kapazität erforderlich, um Multiplexing bekannt Lücken im MDR-TB POC Diagnostik zu adressieren.
Microarrays und die WHO-endorsed Hain Linie Sondentests können die "multiple Gen, mehrere Mutationen" Herausforderung der Diagnose von MDR-TB 8-29 ehen. Leider sind diese Hybridisierung-basierte Multiplex-Detektionsplattformen verwenden mehrstufigen, kompliziert und Open-Amplikon Protokolle, die eine umfassende Ausbildung und Kenntnisse in molekularen Techniken erfordern. Die Verstärkung Microarray-30 wurde entwickelt, um einige dieser Microarray-Work-Flow und Betriebs Anliegen anzusprechen. Die Vereinfachung fluidischen Grundsätze sind zu ergänzen, zu hybridisieren und erkennen Nukleinsäure-Targets in einem einzigen mikrofluidischen Kammer. Der Benutzer stellt die Nukleinsäure-Amplifikation und master mischen in einem fluidischen Kammer mit einer Pipette und startet den Temperaturwechsel-Protokoll. Für die hier gezeigte Stapelverarbeitung Verfahren werden Mikroarrays anschließend in Lösung gewaschen, getrocknet und abgebildet. Diese Studie veranschaulicht die Funktionalität von einem Verstärkungsmikroarray unter Verwendung eines MDR-TB Microarray-Test rpoB (30 Mutationen) katG (2 Mutationen), inhA (4 Mutationen), rpsL (2 Mutationen), embB (1-Mutation), IS1245, IS6110 und eine interne Verstärkung und Hybridisierungskontrolle. Mindestens ein angepaßtes Paar von Mikroarray-Sonden (Wildtyp (WT) und Single-Nukleotid-Mutante (MU)) für jede Mutation von Interesse enthalten. Gereinigte Nukleinsäuren von multiresistenter M. Tuberkulose sind von der TDR-Tuberkulose-Stamm Bank-31. Gel-Element-Microarrays auf Glassubstraten durch Copolymerisation im Wesentlichen hergestellt wie an anderer Stelle 32, mit der Ausnahme, dass wir 4% Monomer und 0,05 mM jede Sonde in der polymerization Mischung. Arrays werden mit einem 50-ml-Dichtung vor der Verwendung umgeben. Nach dem thermischen Zyklus, Hybridisierung und die Waschschritte werden Amplifikation Mikroarrays auf ein tragbares Analyse Akonni abgebildet. Hintergrund-korrigiert, integrierte Signalintensitäten von der rohen erhalten. Tif Bilder mit einem festen Kreis-Algorithmus. Lärm für jedes Gel Element als das Dreifache der Standardabweichung der lokalen Stelle Hintergründe berechnet. Gen-Targets werden in der Regel als nachweisbar Signal-Rausch-Verhältnis (SNR)-Werte ≥ 3. Um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Mutation in jedem Gen oder Codon zu bestimmen, wird eine Diskriminanzanalyse Verhältnis aus den SNR-Werte als (WT-MU) / (WT + MU) berechnet. Diskriminanzanalyse Verhältnisse <0 deuten auf eine Medikamentenresistenz Mutation an der Stelle, während die Verhältnisse> 0 sind bezeichnend für die Wildtyp-Sequenz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ausmaß der mit einer Multiplex-Amplifikation Mikroarray wird letztendlich von der Effizienz der Multiplex-PCR asymmetrisch, nicht das Mikroarray bestimmt wird. Nach unserer Erfahrung können 10-12 einzigartigen Primerpaare leicht zu einer Verstärkung Microarray-Format gemultiplext werden. Herkömmliche Primer-und Sondendesign Kriterien daher, neue Tests, mit Ausnahme, dass man muss auch mögliche Wechselwirkungen zwischen Lösungsphase Nukleinsäuren und Microarray-Sonden immobilisiert, der thermische Wirkungsgrad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health (NIH) unter dem Förder RC3 AI089106 unterstützt.
MDR-TB Nukleinsäuren wurden durch das Kinderhilfswerk der Vereinten Nationen Entwicklungsprogramm Fund / UN / Weltbank / Weltgesundheitsorganisation Sonderprogramm für Forschung und Ausbildung in Tropical Diseases (TDR), Genf, Schweiz zur Verfügung gestellt.
Wir danken Dr. Tom Shinnick der US Centers for Disease Control and Prevention zur Orientierung auf die spezifischen Gene und Mutationen in der Prototypen-Test enthalten.
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
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