Оценка фагоцитарной оформление гибель клеток в экспериментальной инсульта на Ligatable флуоресцентных зондов
Summary
Мы представляем новую технику флуоресценции для селективного на месте маркировки активных фагоцитов, которые ясно от клеточных трупов в ход. Подход важен для оценки реакции мозга к ишемии, поскольку лишь небольшая часть фагоцитов, присутствующих в ишемической мозга участвуют в оформлении гибели клеток.
Abstract
Мы описываем новую гистохимическое подход к визуализации фагоцитарной оформления в фокальной ишемии мозга. Подход позволяет изучать ликвидации отмерших клеток при инсульте по фагоцитов удаления отходов любого сотового линии. Несмотря на многочисленные клетки различного происхождения, которые способны к фагоцитозу присутствуют в ишемическом мозге, только часть из них активно поглощать и переваривать клеток трупов. Избирательное визуализация, количественная и анализ такого активного фагоцитарной сточных управления являются полезными в оценке реакции мозга к ишемии. Эффективное расстояние гибель клеток имеет важное значение для восстановления мозга от ишемического повреждения, как это открывает путь для последующих восстановительных процессов. Неспособность очистить трупы приведет к токсической реакции, вызванной Неискаженный ДНК и белков. Описанная процедура использует флуоресцентных зондов выборочно сшивали вирусной топоизомеразы к характерным разрывов ДНК, полученных во всех фагоцитов во охватеи переваривание клетки необратимо поврежденных ишемией. Метод представляет собой новый инструмент для исследования реакции мозга на ишемического повреждения.
Introduction
Ишемический инсульт вызывает глубокие изменения в пострадавших тканях головного мозга. Она также может инициировать массовую гибель клеток, что приводит к быстрому активации резидентов фагоцитирующих клеток микроглии происхождения. Он также выделяет инфильтрацию ишемической мозга с помощью различных типов крови, полученных профессиональных фагоцитов в том числе нейтрофилы, макрофаги, дендритные, и тучных клеток 1,2.
Это по-прежнему обсуждается, играет ли это ответом на ишемического повреждения положительное или отрицательную роль. Хотя фагоцитоз следующие инсульта может быть выгодно, потому что она очищает омертвевшие клетки и подавляет воспаление, но и образуются токсичные активные формы кислорода влияет выживаемость нейронов и усугубляет повреждение тканей 1-5.
В то время как несколько типов фагоцитов проникнуть ишемический мозг, не все из них участвуют в сточных управления на поглощение клеток трупы и расчистив путь для регенеративных процессов 1-3. Это крeates требование для селективного выявления клеток удаления отходов, которые осуществляют фагоцитарную клиренс гибели клеток при инсульте. При визуализации такие активные клетки регулирования отходов, важно также, чтобы ответить на вопрос, насколько эффективно они ухудшают охвативших сотовые трупы. Самый эффективный и полная деградация ДНК умирающего клетки в фагоцитоза важно, потому что это мешает чувство собственного иммунизации и высвобождение патологического ядерного материала 6.
Здесь мы представляем новые зонды, которые используют конкретные разрывы ДНК в качестве маркеров активных фагоцитов. Эти подписи разрывы исключительно производится в течение пробоя охвативших ядер внутри функциональных клеток удаления отходов. Поэтому зонды избирательно маркировать только те фагоциты, что поглотит и активно переваривать клеточные трупы. Они также позволяют наблюдать интенсивность и завершение пробоя ДНК после охвате. Зонды являются полезными в оценках интенсивности и коэффициентами полезногоency фагоцитарной оформления.
Новые зонды полагаться на маркер небелковой основе и, следовательно, может быть особенно выгодным в исследованиях инсульта, где обширные ишемические повреждения может нарушить клеточной морфологии или истощить маркеры на основе белков, особенно внутри основного ишемической зоне.
Принцип метода представлена на рисунке 1. На рисунке показано шпильки-образный олигонуклеотидных зондов сшивали с помощью фермента коровьей оспы топоизомеразы (VACC ТОРО) чтобы 5'OH концов ДНК, порожденная лизосом аз II в процессе пищеварения ДНК 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом видео мы покажем, в формате разделе ткани, как маркировать активные фагоциты, которые ясно гибель клеток в фокальной ишемии мозга. Представленная методика является первым подходом, который специально этикетки только те ячейки, регулирования отходов, которые охватили и активно п…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом R01NS062842 из Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальных Институтов Здоровья (ВСД) и грантами R21 NS064403 из Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальных Институтов Здоровья через ARRA (ВСД) и R21 EB006301 Национальный институт биомедицинской визуализации и биоинженерии, Национальные институты здравоохранения (ВСД).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
