Vurdere Fagocytisk Rydning af celledød i Eksperimentel slagtilfælde ved ligerbare fluorescerende prober
Summary
Vi præsenterer en ny fluorescens teknik til selektiv in situ mærkning af aktive fagocytceller, som klare off celle lig i slagtilfælde. Den fremgangsmåde er vigtig for vurderingen hjernens reaktion på iskæmi, fordi kun en lille del af fagocytter stede i iskæmisk hjerne deltage i clearance af celledød.
Abstract
Vi beskriver en ny histokemisk metode til visualisering af fagocytisk clearance i fokal hjerne iskæmi. Den tilgang tillader studiet af eliminering af døde celler i slagtilfælde ved affaldshåndtering fagocytter af enhver cellulær afstamning. Selvom mange celler af forskellig oprindelse, der er i stand til fagocytose er til stede i iskæmisk hjerne, kun en del af dem opsluge aktivt og fordøje celle lig. Den selektive visualisering, kvantificering og analyse af en sådan aktiv affaldshåndtering fagocytær er nyttige i forbindelse med vurderingen hjernens reaktion på iskæmi. Effektiv celledød clearance er vigtig for hjernens opsving fra iskæmisk skade, da det åbner vejen for de efterfølgende regenerative processer. Den manglende evne til at rense lig ville resultere i en toksisk reaktion forårsaget af ikke-nedbrudt DNA og proteiner. Den beskrevne fremgangsmåde anvender fluorescerende prober selektivt ligeret med en viral topoisomerase til karakteristiske DNA-brud produceret i alle fagocytter under engulfmentog fordøjelse af celler irreversibelt beskadiget af iskæmi. Metoden er et nyt værktøj til undersøgelse af hjernens reaktion på iskæmisk skade.
Introduction
Iskæmisk slagtilfælde inducerer dybtgående ændringer i de berørte hjernevæv. Den indleder massiv celledød, hvilket fører til en hurtig aktivering af hjemmehørende fagocytceller af microglial oprindelse. Det sætter også off infiltration af iskæmisk hjerne ved forskellige former for blodafledte professionelle fagocytter, herunder neutrofiler, makrofager, dendritiske og mastceller 1,2.
Det er stadig diskuteres, hvorvidt dette svar iskæmisk skade spiller en positiv eller negativ rolle. Selvom fagocytose efter slagtilfælde kan være gavnligt, fordi det rydder døde celler og undertrykker inflammation, det skaber også giftige reaktive ilt arter påvirker neuronal overlevelse og forværrer vævsskader 1-5.
Mens flere typer af fagocytceller infiltrere iskæmisk hjerne, ikke alle af dem deltager i affaldshåndtering ved at opsluge celle lig og rydde vejen for regenerative processer 1-3. Denne creates et krav om selektiv udvælgelse af affaldshåndtering celler, der udfører fagocytotiske clearance af celledød i slagtilfælde. Når billeddannelse sådanne aktive affaldshåndtering celler, er det også vigtigt at besvare spørgsmålet om, hvor effektivt de nedbryder de opslugte celle lig. Den effektive og fuldstændig nedbrydning af døende cellens DNA i fagocytose er afgørende, fordi det forhindrer selv-immunisering og frigivelse af patologisk nukleart materiale 6.
Her præsenterer vi nye sonder, der bruger specifikke DNA pauser som markører af aktive fagocytceller. Disse signatur pauser er udelukkende produceret under nedbrydning af opslugte kerner inde funktionelle affaldshåndtering celler. Derfor sonderne selektivt mærke kun de fagocytter, at opsluge og aktivt fordøje cellulære lig. De tillader også observere intensiteten og færdiggørelse af DNA opdeling efter engulfment. Sonderne er nyttige i evalueringer af intensitet og efficitighed af fagocyterende clearance.
De nye prober er afhængige af en ikke-protein-baserede markør og kan derfor være særligt fordelagtigt i undersøgelser af slagtilfælde, hvor omfattende iskæmisk skade kan forstyrre cellulære morfologi eller nedbryder protein-baserede markører, især inde i kernen iskæmiske zone.
Princippet af teknikken er vist i fig. 1. Figuren viser hårnåle-formet oligonukleotidprober ligeres af enzymet vaccinia topoisomerase (VACC TOPO) til 5'OH DNA ender genereret af lysosomal DNase II under DNA fordøjelse 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne video demonstrerer vi i vævssnittet format, hvordan at mærke aktive fagocytter som klar celledød i fokal hjerne iskæmi. Den præsenterede teknik er den første metode, som specifikt etiketter kun de affaldshåndtering celler, som er opslugt og aktivt fordøje cellulære lig. Dette gør det fordelagtigt med hensyn til andre eksisterende metoder til mærkning af fagocytiske celler, som ikke har denne evne.
Den metode bruger en generel og selektiv DNA-baseret markør for fagocyteren…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af tilskud R01NS062842 fra National Institute of Neurologiske og slagtilfælde, National Institutes of Health (VVD) og ved tilskud R21 NS064403 fra National Institute of Neurologiske og slagtilfælde, National Institutes of Health gennem arra (VVD) og R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging og Bioengineering, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
