אנו מציגים טכניקה חדשה לקרינה סלקטיבית בתיוג באתרו של תאי phagocytic פעילים, אשר ברור מעל גופות תא בשבץ מוחי. הגישה היא חשובה להערכת תגובת המוח לאיסכמיה כי רק חלק קטן מphagocytes נוכח במוח איסכמי להשתתף בפינוי של מוות של תאים.
אנו מתארים גישת histochemical חדשה להדמיה של פינוי phagocytic באיסכמיה המוחית המוקדים. הגישה מאפשרת הלימוד של חיסול של תאים מתים בשבץ מוחי על ידי phagocytes פסולת הניהול של כל שושלת סלולרית. למרות מספר רב של תאים ממקורות שונים כי הם מסוגלים phagocytosis נמצאים במוח איסכמי, רק חלק מהם באופן פעיל לבלוע ולעכל את גופות תא. ההדמיה סלקטיבית, כימות והניתוח של פסולת ניהול phagocytic פעיל אלה מסייעים בהערכת תגובת המוח לאיסכמיה. ניקוי יעיל מוות של תאים חשוב להתאוששות מפציעה המוח איסכמי, כפי שהוא פותח את הדרך לתהליכי התחדשות שלאחר מכן. אי לנקות את הגופות יביאו לתגובה רעילה הנגרמת על ידי דנ"א וחלבונים שאינם מושפלים. ההליך המתואר משתמש בבדיקות ניאון ligated אופן סלקטיבי על ידי topoisomerase נגיפי להפסקות DNA אופייניות המיוצרים בכל phagocytes במהלך היבלעותועיכול של תאים שניזוקו באופן בלתי הפיך על ידי איסכמיה. השיטה היא כלי חדש לחקירה של תגובת המוח לפגיעה איסכמית.
שבץ איסכמי גורם לשינויים עמוקים ברקמת המוח שנפגעה. הוא יוזם מוות של תאים מסיבי, מה שמוביל להפעלה המהירה של תאי phagocytic תושב ממוצא microglial. הוא גם מגדיר את חדירה של מוח איסכמי על ידי סוגים שונים של phagocytes המקצועי דם נגזרות כוללים נויטרופילים, מקרופאגים, הדנדריטים, ותאי פיטום 1,2.
הוא עדיין התלבט אם את התגובה הזאת לפגיעה איסכמית משחקת תפקיד חיובי או שלילי. למרות phagocytosis לאחר שבץ יכול להיות מועיל, כי זה מנקה את תאים מתים ומדכא דלקת, היא גם מייצרת מיני חמצן תגובתי רעילים המשפיעה על הישרדות עצבית ומחריפה את נזק לרקמות 1-5.
בעוד מספר סוגים של תאי phagocytic לחדור מוח איסכמי, לא כולם להשתתף בפסולת ניהול על ידי האופפת גופות תא ופינית את הדרך לתהליכי התחדשות 1-3. CR זהeates דרישה לזיהוי סלקטיבי של תאי פסולת ניהול המבצעות סליקת phagocytic של מוות של תאים בשבץ מוחי. כאשר תאי הדמיה פסולת ניהול פעילים כזה, זה גם חשוב כדי לענות על השאלה של מידת יעילותם לבזות את גופות תא אפופות. השפלה היעילה ומלאה של ה-DNA של התא למות בphagocytosis היא חיונית משום שהוא מונע חיסון עצמי ושחרורו של חומר גרעיני פתולוגי 6.
כאן אנו מציגים בדיקות חדשות העושות שימוש בהפסקות DNA ספציפיות כסמנים של תאי phagocytic פעילים. הפסקות חתימה אלה מיוצרות באופן בלעדי במהלך הפירוק של גרעינים נבלעו בתוך תאים פונקציונליים פסולת ניהול. לכן הבדיקות באופן סלקטיבי רק את תווית phagocytes כי לבלוע ולעכל באופן פעיל גופות סלולריות. הם גם מאפשרים התבוננות בעוצמה והשלמת פירוק ה-DNA לאחר הבליעה. הבדיקות מועילות בהערכות של אינטנסיביות וefficiency של פינוי phagocytic.
הבדיקות חדשות מסתמכות על סמן שאינו מבוסס על חלבון ולכן יכולות להיות יתרון במיוחד במחקרים של שבץ, שבו נזק איסכמי נרחב יכול לשבש את המורפולוגיה תאית או לרוקן סמנים המבוססים על חלבונים, בעיקר בתוך אזור איסכמי הליבה.
העיקרון של הטכניקה מוצג באיור 1. איור מציג בדיקות oligonucleotide בצורת סיכת ראש ligated ידי topoisomerase vaccinia האנזים (VACC TOPO) ל5'OH DNA מסתיים נוצר על ידי lysosomal DNase השני במהלך עיכול ה-DNA 7.
בסרטון הזה אנחנו מדגימים, בפורמט קטע רקמה, איך לתייג phagocytes הפעיל שמוות של תאים ברורים באיסכמיה המוחית המוקדים. הטכניקה המוצגת הינה הגישה הראשונה בי במיוחד תוויות רק אלה תאי פסולת הניהול שפקד את ופעיל לעכל גופות סלולריות. זה עושה את זה יתרון ביחס לשיטות קיימות אחרות ל?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי מענק R01NS062842 מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים לאומיים לבריאות (VVD) ועל ידי מענקי R21 NS064403 מהמכון הלאומיים להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים לאומיים לבריאות באמצעות ערה (VVD) וR21 מכון EB006301 הלאומי ביו הדמיה וההנדסה ביוטכנולוגיה, מכון הלאומי לבריאות (VVD).
Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
Ethanol | |||
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
1 M NaCl | |||
DMSO | Sigma | ||
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
Equipment | |||
Inverted Microscope | Olympus | ||
Digital Video camera and software | Micromax | ||
Software | Metamorph |