連結可能な蛍光プローブによる実験脳卒中における細胞死の貪食クリアランスを評価する
Summary
私たちは、積極的な食細胞のin situラベリングにおける選択のための新しい蛍光技術を提示し、その明確なストローク中の細胞死体オフ。虚血性脳内に存在する食細胞のわずかな割合は、細胞死の隙間に参加しているための方法は、虚血に対する脳の反応を評価するために重要である。
Abstract
我々は、局所性脳虚血に貪食クリアランスの可視化のための新たな組織化学的なアプローチについて説明します。アプローチは、任意の細胞系譜の廃棄物管理の食細胞による行程の死細胞の除去の研究を可能にします。貪食することができる多数の異なる起源の細胞が虚血性脳中に存在するが、それらの一部だけが積極的に飲み込みおよび細胞死体を消化する。このような積極的な食細胞の廃棄物管理の選択的可視化、定量化、および分析は、虚血に対する脳の反応を評価するのに役立ちます。それは、その後の再生プロセスのために道を開くように効率的な細胞死のクリアランスは、虚血性損傷から脳の回復のために重要である。死体をきれいにする失敗は非分解のDNAやタンパク質によって引き起こされる毒性反応をもたらすであろう。説明する手順は、選択的に貪食中にすべての食細胞で生産特性DNA切断にウイルストポイソメラーゼによって連結させた蛍光プローブを使用していますそして不可逆的に虚血により損傷を受けた細胞を消化。この方法は、虚血性傷害に対する脳の反応の調査のための新しいツールです。
Introduction
虚血性脳卒中は、影響を受けた脳組織の大きな変化を誘導する。これは、ミクログリア由来の常在食細胞の急速な活性化をもたらす大量の細胞死を開始する。また、好中球、マクロファージ、樹状、および肥満細胞1,2を含む血液由来のプロ食細胞の様々なタイプによる虚血性脳の浸潤をオフに設定します。
それはまだ、虚血性傷害に対するこの応答は、正または負の役割を果たしているかどうか議論されている。それは死んだ細胞をクリアし、炎症を抑制するため、脳卒中後の貪食が有益であることができますが、それはまた、ニューロンの生存に影響を与えるし、組織損傷1-5を悪化させる有毒な活性酸素種を生成します。
食細胞にはいくつかの種類が虚血性脳を浸透しながら、それらのすべては、細胞の死体を巻き込むと再生プロセス1-3の道をクリアすることによって、廃棄物管理に参加しています。このCR脳卒中における細胞死の貪食クリアランスを行う廃棄物管理の細胞の選択的同定のための要件をeates。このような積極的な廃棄物管理の細胞を撮像する場合、それは彼らが巻き込ま細胞死体を劣化させる方法を効率的に質問に答えることも重要です。それは、自己免疫の病理学および核物質6のリリースを防止するので、食作用で死んで細胞のDNAの効果的かつ完全な分解が不可欠である。
ここでは、アクティブな食細胞のマーカーとして、特定のDNA切断を使用する新しいプローブを提示する。これらの署名ブレークは、排他的な機能の廃棄物管理の細胞内で包ま核の崩壊の間に生産されています。したがってプローブは、選択的に巻き込むだけ食細胞を標識し、積極的に細胞の死体を消化。彼らはまた、貪食後の強度とDNAの分解が完了したことを観察することが可能になる。プローブは、強度とefficiの評価に役立つ貪食クリアランスency。
新しいプローブは、非タンパク質ベースのマーカーに依存しているため、広範な虚血性損傷が細胞形態を混乱させるか、特にコア虚血性ゾーン内に、タンパク質ベースのマーカーを枯渇することができ、脳卒中の研究に特に有利であり得る。
技術の原理を図1に示す。図は、酵素、ワクシニアトポイソメラーゼ（VACC TOPO）によって連結し、ヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブを示している 5'OH DNAにDNA消化7時のリソソームのDNase IIによって生成され終了します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このビデオでは、局所性脳虚血のどの明細胞死アクティブ食細胞を標識する方法を、組織切片の形式で、示しています。提示された技術は、具体的に飲み込まれ、積極的に細胞の死体を消化しているだけの廃棄物管理の細胞を標識する最初のアプローチである。これは、この機能を持っていない貪食細胞の標識化のための他の既存の方法に関して、それが有利になります。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立神経疾患·脳卒中研究所、国立衛生研究所（VVD）と神経疾患や脳卒中の国立研究所からの補助金、R21 NS064403によって、ARRA（VVD）とR21を介して国立衛生研究所からの助成金R01NS062842によってサポートされていました生物医学イメージングとバイオエンジニアリングEB006301国立研究所、国立衛生研究所（VVD）。
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
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