Vurdere phagocytic Clearance av celledød i Experimental Stroke av Ligatable fluorescerende prober
Summary
Vi presenterer en ny fluorescens teknikk for selektiv in situ merking av aktive fagocytiske celler, noe som klart utenfor celle likene i slag. Tilnærmingen er viktig for vurdering av hjernen reaksjon på ischemi, fordi bare en liten del av fagocytter som er tilstede i iskemiske hjerne deltar i utskillelse av celledød.
Abstract
Vi beskriver en ny histochemical tilnærming for visualisering av phagocytic klaring i focal hjerne iskemi. Fremgangsmåten tillater studiet av eliminering av døde celler i slag med avfall-styrings fagocytter av alle cellulære avstamning. Selv om tallrike celler av forskjellig opprinnelse som er i stand til fagocytose er til stede i ischemisk hjerne, bare en del av dem aktivt sluker og fordøye celle lik. Den selektive visualisering, kvantifisering og analyse av slik aktiv fagocyttfunksjon avfall-ledelse er nyttig i vurderingen av hjernen svar på iskemi. Effektiv celledød klaring er viktig for hjerne utvinning fra iskemisk skade, da den åpner veien for de etterfølgende regenerative prosesser. Unnlatelse av å rense likene ville resultere i en giftig reaksjon forårsaket av ikke-degradert DNA og proteiner. Den beskrevne fremgangsmåten bruker fluorescerende prober selektivt bindes sammen av en viral topoisomerase til karakteristiske DNA pauser produsert i alle fagocytter under engulfmentog fordøyelse av celler irreversibelt skadet av iskemi. Metoden er et nytt redskap for undersøkelse av hjernen reaksjon på iskemisk skade.
Introduction
Iskemisk hjerneslag induserer dyptgripende endringer i de berørte hjernevev. Det initierer massiv celledød, noe som fører til rask aktivering av fastboende fagocytiske celler av microglial opprinnelse. Det setter også av infiltrasjon av iskemisk hjernen ved ulike typer blod-avledet profesjonelle fagocytter inkludert nøytrofile, makrofager, dendrittiske, og mastceller 1,2.
Det er omdiskutert hvorvidt dette svaret til iskemisk skade spiller en positiv eller en negativ rolle. Selv fagocytose etter hjerneslag kan være gunstig fordi det klarner døde celler og undertrykker betennelse, genererer det også giftige reaktive oksygen arter påvirker nevronale overlevelse og forverrer vevsskade 1-5.
Mens flere typer fagocyttiske celler infiltrere iskemisk hjerne, ikke alle av dem deltar i avfall-ledelse ved engulfing celle likene og rydde veien for regenerative prosesser 1-3. Dette creates et krav for selektiv identifisering av avfall-ledelse celler som utfører phagocytic clearance av celledød i slag. Når imaging slike aktive avfall-ledelse celler, er det også viktig å svare på spørsmålet om hvor effektivt de degradere de oppslukt celle likene. Den effektive og fullstendig nedvurdering av den døende cellens DNA i fagocytose er viktig fordi det hindrer selv immunisering og utgivelsen av patologisk kjernefysisk materiale seks.
Her presenterer vi nye prober som bruker spesifikke DNA pauser som markører for aktive fagocyttiske celler. Disse signatur pauser er utelukkende produseres under nedbrytning av oppslukt kjerner inne funksjonelle avfall-ledelse celler. Derfor sondene selektivt merke bare de fagocytter som sluker og aktivt fordøye cellulære lik. De tillater også at man intensiteten og komplettering av DNA nedbrytning etter engulfment. Sondene er nyttig i evalueringer av intensitet og effektivitetency av phagocytic klaring.
De nye prober er avhengige av en ikke-protein-baserte markør og kan derfor være spesielt fordelaktig i studier av slag, hvor omfattende iskemisk skade kan forstyrre cellulær morfologi eller utarme proteinbaserte markører, spesielt inne i kjernen ischemiske sonen.
Prinsippet for teknikken er presentert i figur 1.. Figuren viser hårnål-formet oligonukleotidprober ligert av enzymet vaccinia topoisomerase (VACC TOPO) til 5'OH DNA ender generert av lysosomal DNase II under DNA fordøyelsen 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette video viser vi, i vevet delen format, hvordan man skal merke aktive fagocytter som klart celledød i fokal hjerne-ischemi. Den presenterte teknikken er den første tilnærmingen som spesifikt etiketter bare de avfall-ledelse celler som har oppslukt og aktivt fordøye cellulære lik. Dette gjør det fordelaktig i forhold til andre eksisterende metoder for merking av fagocytiske celler, som ikke har denne evne.
Metoden bruker en generell og selektiv DNA-baserte markør for fagocyttisk …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av stipend R01NS062842 fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag, National Institutes of Health (VVD) og med tilskudd R21 NS064403 fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag, National Institutes of Health gjennom Arra (VVD) og R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
