Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu
Summary
Mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri dış membran ile ilişkilidir. Biz ilişkili mRNA'lardan ve ribozomlarla maya mitokondri izolasyonu amaçlayan bir hücre altı bölme prosedürü tarif. Bu protokol, mRNA lokalizasyonu mekanizmaları ve mitokondri yakın olarak lokalize çeviri ortaya çıkarmak için çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler uygulanabilir.
Abstract
Mitokondriyal proteinlerin çoğu çekirdeğine kodlanmış ve organel içine ithal edilecek ihtiyacı vardır. Protein, mitokondri yakın sentezlenir Alma oluşabilir. Bu olasılığı için destek mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri civarı lokalize edilmesi gösterilmiştir edildiği son çalışmalar, türetilmiştir. Birlikte dış zar ile ribozomların 'derneği önceki gösterileri ile, bu sonuçlar yerelleştirilmiş bir çeviri sürecini öneririz. Bu tür lokalize çeviri, ithalat verimliliğini artırmak benzersiz düzenleme siteleri sağlamak ve ektopik ifade vakalarını minimize edebilir. Çeşitli yöntemler lokalize çeviri aracılık faktörler ve unsurları karakterize etmek için kullanılmıştır. Bunlar arasında standart diferansiyel santrifüjle hücre içi fraksiyonlarının. Bu protokol, tek bir prosedür olarak mRNA, ribozomlar ve proteinlerinin izolasyonu gibi bir avantajı vardır. Bunlar daha sonra çeşitli moleküler ve bi karakterize edilebilirochemical yöntemleri. Ayrıca, transkriptomik ve proteomik yöntemleri böylece genom çapında derin bir bakış açısı sağlar, elde edilen malzemeye uygulanabilir. Bu çalışmalar için bir model organizma olarak maya kullanımı hızı, maliyetler ve basitlik avantajları vardır. Ayrıca, gelişmiş bir genetik araçları ve mevcut silme suşları aday faktörlerin incelenmesini kolaylaştırmak.
Introduction
Ökaryotik hücreler, belirli işlevleri olan farklı bölümlerinde düzenlenmektedir. Bu fonksiyonu yerine getirmek için, her bir bölme bu etkinlik için temel olan protein benzersiz bir dizi içerir. Bu proteinler bölmesini hangi yaklaşımı sayesinde mümkün olan bir mekanizma lokalize çeviri 1,2 gereğidir. Bu işlemde, protein ribozomlar ve orada bulunan mRNA tarafından hedefe sentezlenir. Lokalize çeviri muhtemel avantajları protein hedeflemesi verimliliği artmış arasında protein chaperones ihtiyacının azalması ve site-spesifik düzenleme mekanizmalarını sağlayarak. Ayrıca, lokalize mRNAlarının ve ribozomlar genel çeviri inhibe hücresel stres, durumlarında çeviri makine tenha bir rezervuar olabilir.
Mitokondri son yıllarda lokalize çeviri incelemek için merkezi bir model oldu. En mitokondri proteinleri, sitosol tercüme çekirdeğinde, kodlanmıştırve organel içine ithal. Kanıtlar çeşitli çizgiler, bu proteinler çoğu yerel için bir süreç yoluyla üretilmiş olduğunu göstermektedir. Başlangıçta, elektron mikroskobu ve biyokimyasal bölme çalışmaları mitokondri 3-5 ile ilişkili ribozomlan algılandı. Sonra sadece bir cotranslational şekilde 6,7 ithal edilecek bulundu belirli mRNA'lardan çalışmalardan in vivo doğrulanmıştır Bu çalışmalar. Mitokondri ile ilişkili mRNA genom çalışmalar mRNA önemli bir kısmı mitokondri civarı 8-10 lokalize olduğunu ortaya çıkardı. Bu mRNA bazıları ayrıca, balık veya MTAG 9,11 olarak in vivo floresan yöntemler ile karakterize edilmiştir. Bu derneğin bir düz ileri yorumlama bu mRNAlarının lokalize çeviri için şablon olarak hizmet olmasıdır.
Bu mRNAları mitokondri yaklaşım hangi mekanizmalar bilinmemektedir. Noncoding etki (en significantly 3 'UTRs) mitokondri 12 mRNA birlikte dahil olmak gösterilmiştir. Bu etki kendi taşıma aracılık eden RNA bağlayıcı proteinlere bir bağlama alanı olarak hizmet etmek olasıdır. Mayada çalışmalar proteinlerin PUM ailesinin (Puf3) üyesi mitokondri 8,13 ile mRNA ilişki desteklediğini göstermiştir. Diğer aile üyelerinin fonksiyonları dayanmaktadır Puf3 için mantıklı bir rolü, mRNA rota 14 tr ise çeviri inhibe etmektir. Bu durumda, mRNA kodlayıcı olmayan bölgeler ile etkileşime RNA bağlayıcı protein tarafından, bir çevrilmemiş durumu nakledilebilir. Seçenek olarak ise, işin büyük bir gövde, protein sentez edilirken taşıma cereyan ettiğini ortaya çıkarmaktadır. Özellikle de, çeviri inhibitörleri mRNA'lar ilişki 8,13 etkilediği gösterilmiştir. Ayrıca, bu tür Ağustos olarak tercüme özellikleri, mitokondriyal hedefleme sekansı (MTS) ya da ORF bölgeler lokalizasyon 8,11,15 yardımcı gösterilmiştir. Hsp70-family protein chmitokondri dış zar üzerinde aperone ve protein reseptör daha da kodlanmış protein özellikleri mRNA lokalizasyonu 16 için önemli olduğunu ima, mRNA ilişki destek gösterilmiştir. Bu, ribozom ortaya çıkan protein mitokondri 17 mRNA ribozom-protein kompleksi hedefleme için tanıma elemanı olarak hizmet ettiği bir modelle tutarlıdır.
Mitokondri yakın olarak lokalize için elektron mikroskopisi (ribozomlar görselleştirmek için) 3, FISH 9, (spesifik mRNA tespit etmek için), yeşil RNA 11 ve biyokimyasal fraksiyonasyon (RNA ve hem ribozomlar tespit etmek için) 10,18 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler ile araştırılmıştır. Eski yöntemler, canlı ortam içinde lokalizasyonu tespit etmek ve taşıma dinamikleri görselleştirme izin verirken, ikinci tek bir deneyde bir çok farklı mRNA tespiti sağlar. Ayrıca, biyokimyasal ayırma kodlayıcı veya kodlayıcı olmayan bir etki için al olması gerekmezolarak girilir, bu nedenle belirli bir rolleri değerlendirilebilir. Biyokimyasal ayırma başarılı bir şekilde bir çok farklı hücre bölmelerinin izole edilmesi için, uzun yıllardır kullanılmaktadır. Onun ilke ve sınırlamaları iyi kurulmuş, ve kolayca farklı bir amaç için mevcut protokolleri değiştirebilirsiniz. Gerekli enstrümantasyon, bu nedenle genellikle hücre içi lokalizasyonu eğitim için tercih edilen ilk yöntemdir, birçok laboratuvar standarttır. Biz, ribozomlar mitokondri ile ilişkili ise mRNA izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol açıklar. Bu protokol, bu nedenle mitokondri yakın lokalize çeviri katılan faktörleri incelemek için en uygunudur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Görüntülemede Teknolojik gelişmeler mRNA yerelleştirme incelemek için yüksek çözünürlüklü araçları vermiştir. Bugün, bir msn zaman ölçeği 23-26 hatta tek bir mRNA molekülünün hareketini ölçebilirsiniz. Bununla birlikte, geleneksel biyokimyasal yaklaşımlar, yukarıda tarif edilen gibi, aynı zamanda bilgi ve bazı durumlarda tercih edilir. Biyokimyasal izolasyon mRNA ve proteinlerin büyük bir repertuar saflaştırılmasını sağlar ve genom çalışmaları için bu nedenle tercih …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr teşekkür ederim. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines ve bu protokolün kurulması sırasında yardım ve yorumlar için Doron Rapaport. Bu çalışma ISF (hibe sayısı 1193-1109) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., Bonifacino, J. S., et al. . Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
