Aktivering og måling af NLRP3 Inflammasome Aktivitet hjælp af IL-1β i Human monocytafledte dendritiske celler

Summary

Dendritiske celler (DC'er) udskiller IL-1β som reaktion på TLR8 anerkendelse af syntetisk purin, R848, efterfulgt af NLRP3 inflammasome aktivering med nigericin derfor IL-1β kan anvendes til at måle NLRP3 inflammasome aktivitet. Intracellulær cytokin farvning, immunoblotting og ELISA anvendes til præcist at måle NLRP3 inflammasome priming og aktivering via IL-1β udtryk.

Abstract

Inflammatoriske processer som følge af udskillelsen af Interleukin (IL) -1 familie cytokiner immunceller føre til lokal eller systemisk inflammation, vævsremodellering og reparation, og virologisk kontrol ^{1, 2.} Interleukin-1β er et væsentligt element i den medfødte immunreaktion og bidrager til at fjerne invaderende patogener samtidig forhindre etableringen af vedvarende infektion ^1-5.

Inflammasomes er nøglen signalering platform for aktivering af interleukin 1-omdannende enzym (ICE eller Caspase-1). NLRP3 inflammasome kræver mindst to signaler i udviklingslandene til at forårsage IL-1β sekretion ^6. Pro-IL-1β-protein ekspression er begrænset i hvilende celler; derfor priming signal er påkrævet til transkription af IL-1β og proteinekspression. Et andet signal registreres af NLRP3 resulterer i dannelsen af ​​multi-protein NLRP3 inflammasome. Evnen af ​​dendritiske celler til ansvard til de signaler, der er nødvendige for IL-1β-sekretion kan testes ved hjælp af en syntetisk purin, R848, som afføles af TLR8 i human monocyt dendritiske celler (moDCs) for at prime celler, efterfulgt af aktivering af NLRP3 inflammasome med det bakterielle toksin og kalium ionofor, nigericin.

Monocytafledt DCer let produceres i kultur og give betydeligt flere celler end oprenset humant myeloide udviklingslandene. Metoden præsenteres her adskiller sig fra andre inflammasome assays i, at det bruger humane in vitro, i stedet for mus afledt, DCs således giver mulighed for studiet af inflammasome i human sygdom og infektion.

Introduction

Aktivering af medfødte immunsystem er nødvendig for at styre adaptive immunrespons under infektion, sygdom og vaccination ^7.. Dendritiske celler er de mest potente antigenpræsenterende celler i det medfødte immunsystem; de er specialiseret til optagelse af antigener, migration til lymfeknuder, og aktivering af naive CD4 ⁺ og cytolytiske CD8 ⁺ T-celler ^8-10. For at muliggøre hurtig afsløring patogen det medfødte immunsystem udnytter mange kimlinie kodet mønstergenkendelse receptorer (PRR), der genkender bevaret patogen afledte motiver eller værten afledte markører for celle stress og skader. Toll lignende receptorer (TLRs) er membranbundne mønstergenkendelse receptorer, der genkender visse ekstracellulære phagocytized patogen tilknyttede molekylære mønstre (PAMPs) og fare forbundet molekylære mønstre (dæmper). Derimod nik lignende receptorer (NLRs) er cytosol og reagere på en bred vifte af PAMPs og dæmper. Nik lignende receptorer refremlægge en anden linje i forsvaret mod patogener, der unddrage celleoverfladen og endocytiske PRRs. Samspillet mellem patogen afledt eller "fare" i forbindelse faktorer med TLR og NLR ligander fører til en tilstand af DC-modning resulterer i øget DC samspil med andre immunceller og fremme af T-celle-og killer celle aktivering ¹¹ naturlige.

Interleukin-1β er en afgørende komponent i værtens forsvar mod infektion. Ved anerkendelse af en mikroorganisme, det stærkt proinflammatorisk cytokin, IL-1β secerneres og fungerer som et kemo lokkemidler og aktivator af medfødte og adaptive immunceller. In vivo IL-1β er hovedansvarlig for den akutfaserespons herunder feber og inflammatoriske cytokin syntese ^12..

De fleste NLRs indeholde en C-terminale leucin rich repeat domæne, der menes at fungere i ligand sensing, en central nukleotid bindingsdomæne (NACHT), som er indførtant for NLRP3 oligomerisering, og en N-terminal effektordomæne (PYD i NLRP3), der medierer signaltransduktion downstream mål gennem protein protein interaktioner. NLRP3 protein definerer mest intenst studerede inflammasome kompleks. Dette protein er et medlem af NLR familien og har evnen til at danne en multi molekylær proteinkompleks består af NLRP3 adapteren protein PYCARD (også kendt som ASC) og ICE. Ved inflammasome aktivering PYCARD binder til NLRP3 N-terminale domæner og rekrutterer ICE via caspaseaktivering og rekruttering domæne (CARD) domæner. Interleukin-1-omdannende enzym indledningsvis genereres som et zymogen indeholdende en CARD motiv ved dets N-terminale ende. Inflammasome dannelse resulterer i at bringe to ICE molekyler tilstrækkelig tæt til at fremkalde deres autokatalytisk aktivering. Inflammasome kompleks er nødvendig for at aktivere ICE hvilket gør det muligt at omdanne cytoplasmisk pro-IL-1β til moden cytokin.

Vellykket sekretion af IL-1β i udviklingslandene kræver sensing af to forskellige og uafhængige faresignaler. Først TLR sensing af PAMPs, dæmper eller cytokin signalering (TNFa eller IL-1β) forårsager en opregulering af cytoplasmisk pro-IL-1β-protein-ekspression. Der kræves en anden, ofte anderledes, signal for inflammasome kompleks dannelse opstrøms af ICE modning. Et par inflammasome stimulerende signaler omfatter bakteriemembran poredannende toksiner (såsom nigericin), lysosomale forstyrre krystaller (såsom mononatrium uratkrystaller, MSU) og ekstracellulær ATP. Den opstrøms mekanisme, der fører til NLRP3 inflammasome aktivering af disse forskellige aktivatorer er uklar. Undersøgelser af signalering opstrøms inflammasome dannelse foreslår, at intracellulære begivenheder, såsom induktion af hypokaliæmi eller reaktive ilt arter (ROS) indirekte aktivere inflammasome ^13-28.

Blandt de forskellige virale aktivatorer af NLRP3 inflammasome er influenza, som giver bAn den primære og sekundære signal kræves for IL-1β sekretion ^{3, 29-33.} Brug af mus NLRP3 knockout modeller blev det fundet, at IL-1β-sekretion i DC'er er NLRP3 afhængig ^32. Derudover NLRP3 knockout-mus tiltrak færre leukocytter til stedet for infektion og oplevet højere dødelighed ^{2, 5.} To nylige papirer foreslå en mekanisme til NLRP3 inflammasome aktivering under Influenza virus infektion; første priming gennem anerkendelse af viral RNA ved TLR7 eller TLR8 (afhængigt TLR ekspression af den responderende celle) eller ved detektering af kommensale bakterier af andre TLRs at inducere cytoplasmatisk pro-IL-1β ekspression, efterfulgt af et andet signal, aktivering af NLRP3 inflammasome dannelse af viral ionkanalproteinet M2 på det transeuropæiske Golgi netværket ^{33, 34.} I sidstnævnte trin, der udløser den NLRP3 inflammasome opnås ved forstyrrelse af den intracellulære ioniske <em> miljø, der fører til produktionen af ROS, hvilket er simpelthen, afføles af NLPR3 som et signal til at danne inflammasome. Men den præcise mekanisme af inflammasome aktivering opstrøms af ICE aktivitet under Influenza infektion stadig uklart.

Dette arbejde beskriver en teknik værdifuld til at studere NLRP3 inflammasome i menneskelige moDCs, der kan bruges som et fundament for yderligere undersøgelse af vejen bag DC baseret IL-1β sekretion som respons på TLR8 ligatur med R848 efterfulgt af aktivering af inflammasome ved et godt kendt aktivator af NLRP3, nigericin. Variationer af denne fremgangsmåde kan anvendes med andre celletyper, herunder, men ikke begrænset til: monocytter, makrofager, andre DC delmængder og epitelceller.

Protocol

Etik Statement: Forskning prøverne tages og opbevares til forskning med donorernes samtykke. Alle prøver skal kodes eller anonymiseret før brug. Denne protokol følger retningslinjerne i vores Institutional Review Board. 1.. Differentiering af humane perifere blod-Monocyter i monocytafledt dendritiske celler. Bemærk: Menneske buffy coats tjene som kilde til humane perifere blodceller (PBMC'er) og blev opnået fra New York Blood Center (New York, NY). Bloddo…

Representative Results

Disse teknikker måler TLR8 priming med R848. Intracellulær cytokin farvning for pro-IL-1β giver mulighed for mikroskopi og FACS udlæsninger fra CD14 – CD11c + moDCs. Begge teknikker kan kvantificeres i forhold til en ikke-primet eller hvile, cellekontrol samt en isotypekontrol (figur 1 og 2). Procent af pro-IL-1β + farvning af celler multipliceres med den geometriske medianen af denne population for at give den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI). MFI kan sam…

Discussion

Inflammatoriske cytokiner er integreret i styringen af ​​medfødte og adaptive immunrespons til at bekæmpe virusinfektion. Udskilt IL-1β har vist sig at stige i løbet af influenza-infektion, ^{3, 43, 44.} De præcise mekanismer, hvormed disse cytokiner behandles som reaktion på viral anerkendelse humane dendritiske celler er ikke fuldt forstået. Myeloide DC isolation kits er dyrt og tidskrævende. Isolation kits og FAC sortering kan utilsigtet stress eller aktivere cellerne. Derudover er der ofte utilst…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12-well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96-well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12 % polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
α-CD11c	BD	555392
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
Gentamicin	Invitrogen	15750060
Hepes	Invitrogen	15630080
goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol – 4L	Fisher Scientific	A433P-4
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P-36931
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707