Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen
Summary
Dendritische cellen (DCs) scheiden IL-1β reactie op TLR8 erkenning van synthetische purine, R848, gevolgd door NLRP3 inflammasome activering met nigericine derhalve IL-1β kunnen worden gebruikt om NLRP3 inflammasome te meten. Intracellulaire cytokine kleuring, immunoblotting en ELISA worden gebruikt om NLRP3 inflammasome priming en activering van IL-1β expressie nauwkeurig te meten.
Abstract
Ontstekingsprocessen gevolg van de secretie van interleukine (IL) -1 familie cytokinen door immuuncellen tot lokale of systemische inflammatie, weefselremodellering en reparatie en virologische controle 1, 2. Interleukine-1β is een essentieel onderdeel van de aangeboren immuunrespons en draagt bij aan elimineren binnendringende ziekteverwekkers terwijl het voorkomen van de oprichting van persisterende infectie 1-5.
Inflammasoom zijn de belangrijkste signalerende platform voor de activering van interleukine 1 omzettend enzym (ICE of Caspase-1). De NLRP3 inflammasoom vereist ten minste twee signalen in DCs tot IL-1β secretie 6 veroorzaken. Pro-IL-1β eiwitexpressie wordt beperkt in rustende cellen; dus een priming signaal vereist voor IL-1β transcriptie en eiwitexpressie. Een tweede signaal gedetecteerd door NLRP3 resulteert in de vorming van multi-eiwit NLRP3 inflammasome. Het vermogen van dendritische cellen om verantwoordelijkheidd de signalen vereist voor IL-1β secretie kan worden getest met behulp van een synthetisch purine, R848, die wordt waargenomen door TLR8 in menselijke monocyten afgeleide dendritische cellen (moDCs) prime cellen, gevolgd door activering van de NLRP3 inflammasome de bacteriële toxine en kalium ionofoor, nigericine.
Monocyten afgeleide DCs zijn gemakkelijk geproduceerd in cultuur en geven significant meer cellen dan gezuiverde humane myeloïde DCs. De hier gepresenteerde methode verschilt van andere inflammasome assays die het gebruikt in vitro humane plaats van muizen afgeleide DCs waardoor voor de studie van de inflammasome in humane ziekten en infecties.
Introduction
Activering van aangeboren immuunsysteem moet adaptieve immuunreacties sturen tijdens infectie, ziekte en vaccinatie 7. Dendritische cellen zijn de meest krachtige antigeen-presenterende cellen van het aangeboren immuunsysteem; Zij zijn gespecialiseerd voor de opname van antigenen, migratie naar lymfeklieren en activatie van naïeve CD4 + en CD8 + cytolytische T-cellen 8-10. Om een snelle detectie van pathogenen in staat het aangeboren immuunsysteem maakt gebruik van tal van kiembaan gecodeerde patroonherkenning receptoren (PRR) dat geconserveerde pathogeen afgeleide motieven of gastheer afgeleide markers van cel stress en schade te herkennen. Toll like receptoren (TLR's) zijn membraangebonden patroonherkenning receptoren die bepaalde extracellulaire phagocytized pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en gevaar geassocieerde moleculaire patronen (dempt) herkennen. Daarentegen knipoog like receptoren (NLRs) zijn cytosolische en reageren op een breed scala van PAMPs en DAMPs. Knikken like receptoren opnieuwpresenteren een tweede verdedigingslinie tegen pathogenen die celoppervlak en endocytische PRRs ontwijken. De interactie van pathogeen afgeleide of "gevaar" verbonden factoren TLR-liganden en NLR leidt tot een toestand van DC rijping leidt tot een verhoogde DC interactie met andere cellen en stimulering van T-cellen en natuurlijke killer cel activatie 11.
Interleukine-1β is een cruciaal onderdeel van de afweer tegen infecties. Bij herkenning van een micro-organisme, de zeer pro-inflammatoire cytokine IL-1β, wordt uitgescheiden en functioneert als een chemo attractant en activator van aangeboren en adaptieve immuunsysteem cellen. In vivo IL-1β is grotendeels verantwoordelijk voor de acute fase respons waaronder koorts en inflammatoire cytokine synthese 12.
De meeste NLRs bevatten C-terminale leucine rich repeat domein waarvan wordt gedacht dat functioneert ligand detectie, een centrale nucleotide bindend domein (NACHT) die important voor NLRP3 oligomerization, en een N-klem effector domein (PYD in NLRP3) dat signaaltransductie bemiddelt naar stroomafwaartse doelwitten via eiwit-eiwit interacties. De NLRP3 eiwit bepaalt de meest intensief bestudeerde inflammasome complex. Dit eiwit is een lid van de familie NLR en heeft de mogelijkheid om een multi moleculaire eiwitcomplex samengesteld NLRP3, de adaptor eiwit PYCARD (ook bekend als ASC) en ICE vormen. Bij inflammasoom activering PYCARD bindt aan NLRP3 N terminale domeinen en werft ICE via caspaseactivering en werving domein (CARD) domeinen. Interleukine-1 omzettend enzym wordt aanvankelijk geproduceerd als een zymogeen dat een CARD motief aan zijn N-terminus. Inflammasoom formatie resultaten in het brengen van twee ICE moleculen dicht genoeg bij hun autokatalytisch activering induceren. Inflammasome complex is noodzakelijk voor het activeren ICE waardoor deze cytoplasmatische pro-IL-1β omzetten cytokine rijpen.
Succesvolle secretie van IL-1β in DCs vereist sensing van twee verschillende en onafhankelijke gevaar signalen. Eerste, TLR sensing van PAMPs, DAMPs of cytokine signaling (TNF of IL-1β) veroorzaakt een verhoogde expressie van cytoplasma pro-IL-1β eiwit expressie. Een tweede, vaak verschillend, signaal nodig inflammasome complexvorming vóór ICE rijping. Enkele inflammasoom stimulerende signalen omvatten bacteriële porie vormende toxinen (zoals nigericine), lysosomale verstoren kristallen (zoals monosodium uraat kristallen, MSU) en extracellulair ATP. De upstream-mechanisme dat leidt tot inflammasome activering NLRP3 door deze diverse activatoren is onduidelijk. Onderzoeken naar signalering stroomopwaarts van inflammasome formatie stelt dat intracellulaire gebeurtenissen, zoals inductie van hypokaliëmie of reactive oxygen species (ROS) indirect activeren inflammasome 13-28.
Onder de verschillende virale activatoren van de NLRP3 inflammasome is influenza, waarbij b voorzietOTH de primaire en secundaire signaal dat nodig is voor IL-1β secretie 3, 29-33. Gebruik makend van muis NLRP3 knockout modellen werd gevonden dat IL-1β secretie DCs NLRP3 afhankelijk 32. Bovendien NLRP3 knockout muizen minder aangetrokken leukocyten naar de plaats van infectie en ervaren hogere mortaliteit 2, 5. Twee recente papers suggereren een mechanisme voor NLRP3 inflammasome activatie tijdens Influenza virus infectie; eerste, priming door herkenning van viraal RNA door TLR7 en TLR8 (afhankelijk TLR expressie van de reagerende cel) of door detectie van commensale bacteriën door andere TLRs cytoplasmatische pro-IL-1β expressie te induceren, gevolgd door een tweede signaal, activering van NLRP3 inflammasoom vorming door virale ionkanaal eiwit M2 op het trans Golgi netwerk 33, 34. In de laatste stap, activering van de NLRP3 inflammasome wordt bewerkstelligd door verstoring van de intracellulaire ionische <em> milieu leidt tot ROS productie, die eenvoudig, gedetecteerd door NLPR3 als signaal naar de inflammasome vormen. De precieze mechanisme van activatie inflammasome stroomopwaarts van ICE activiteit gedurende Influenza infectie nog steeds onduidelijk.
Dit werk beschrijft een techniek voor het bestuderen van de waardevolle NLRP3 inflammasome in menselijke moDCs die kan worden gebruikt als een basis voor verder onderzoek van de pathway DC gebaseerd IL-1β secretie in reactie op TLR8 ligatie met R848 gevolgd door activering van de inflammasome door een goed bekende activator van NLRP3, nigericine. Variaties van deze werkwijze kan worden gebruikt met andere celtypen waaronder, maar niet beperkt tot: monocyten, macrofagen, andere DC subsets en epitheelcellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inflammatoire cytokines zijn integraal in het sturen van het aangeboren en adaptieve immuunrespons tegen virale infecties te bestrijden. Afgescheiden IL-1β is aangetoond verhogen tijdens Influenza infectie 3, 43, 44. Het precieze mechanisme waardoor deze cytokinen worden verwerkt in reactie op virale erkenning humane dendritische cellen niet volledig begrepen. Myeloïde DC isolatie kits zijn duur en tijdrovend. Isolatie kits en FAC sortering kan onbedoeld stress of activeren van de cellen. Daarnaast is er va…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., en Meagan O'Brien, MD erkennen voor hun steun en feedback. Dit onderzoek werd gesteund door het Nationale Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekte en aangevuld met financiering van NIH verleent Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards voor Individuele predoctorale beurzen (F31) om diversiteit in Health-Related Research (AI089030) en RO1 (AI081848 bevorderen ).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12-well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96-well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12 % polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| α-CD11c | BD | 555392 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol – 4L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P-36931 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
References
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
- Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
- Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
- Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
- Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
- Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. , (2013).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
- Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
- Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
- Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
- Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
- Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
- Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
- Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
- Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. , (2012).
- Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
- Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
- Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
- Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
- Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
- Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
- Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
- Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
- Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
- Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
- Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
- Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
- Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
- Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
- Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
- Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
- Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
- O’Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
- Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
- Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
- Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
- Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
- Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
- Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
- Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
- Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).
