Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen
Summary
Dendritische Zellen (DCs) sezernieren IL-1β in Reaktion auf TLR8 Anerkennung von synthetischen Purin, R848, gefolgt von NLRP3 Inflammasom Aktivierung mit Nigericin daher, IL-1β kann verwendet werden, um NLRP3 Inflammasom Aktivität zu messen. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung, Immunoblotting und ELISA werden verwendet, um NLRP3 Inflammasom Grundieren und Aktivierung über IL-1β Ausdruck genau zu messen.
Abstract
Entzündliche Prozesse von der Sekretion von Interleukin (IL) -1 resultierenden Familie Zytokinen durch Immunzellen führen zu lokalen oder systemischen Entzündung, Gewebeumbau und Reparatur, und virologische Kontrolle 1, 2. Interleukin-1β ist ein wesentlicher Bestandteil der angeborenen Immunantwort und trägt zu beseitigen eindringende Krankheitserreger und verhindert die Schaffung persistierende Infektion 1-5.
Inflammasomes der Schlüssel Signalisierungsplattform für die Aktivierung von Interleukin-1-Converting-Enzym (ICE oder Caspase-1). Die NLRP3 Inflammasom erfordert mindestens zwei Signale in DCs zu IL-1β Sekretion 6 verursachen. Pro-IL-1β-Protein-Expression in ruhenden Zellen begrenzt; daher ist für die IL-1β-Transkription und Proteinexpression eine Vorlaufsignal erforderlich. Ein zweites Signal von NLRP3 zur Bildung des Multiprotein NLRP3 inflammasome erfaßt. Die Fähigkeit der dendritischen Zellen zur Verantwortungd, die für die IL-1β-Sekretion erforderlichen Signale können unter Verwendung eines synthetischen Purin, R848, die durch TLR8 in menschlichen Monozyten prime Zellen gewonnenen dendritischen Zellen (MoDCs) abgetastet wird, gefolgt von der Aktivierung des NLRP3 inflammasome mit dem bakteriellen Toxin getestet werden und Kalium-Ionophor Nigericin.
Monozyten-abgeleiteten DCs sind leicht in Kultur produziert und bieten deutlich mehr Zellen als gereinigte menschliche myeloische DCs. Das hier vorgestellte Verfahren unterscheidet sich von anderen inflammasome Assays dadurch, dass sie in vitro menschliche anstelle der Maus abgeleitete DCs so dass für die Untersuchung der inflammasome in menschlichen Erkrankungen und Infektionen.
Introduction
Die Aktivierung des angeborenen Immunsystems ist erforderlich, um adaptive Immunantwort während der Infektion, Krankheit und Impfung 7 lenken. Dendritische Zellen sind die wirksamsten Antigen-präsentierenden Zellen des angeborenen Immunsystems; sie für die Aufnahme von Antigenen, die Migration in die Lymphknoten und die Aktivierung von naiven CD4 + und CD8 +-cytolytischen T-Zellen 8-10 spezialisiert sind. Um eine schnelle Erregernachweis ermöglichen das angeborene Immunsystem nutzt zahlreiche Keimbahn kodiert pattern recognition receptors (PRR), die konservierte Pathogen abgeleiteten Motive oder Wirt stammt Marker der Zellstress und Schäden zu erkennen. Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind Membran-gebundene Mustererkennungsrezeptoren, die bestimmte extrazelluläre Erreger phagozytierten associated molecular patterns (PAMPs) und Gefahren associated molecular patterns (gedämpft) zu erkennen. Im Gegensatz Nicken like Rezeptoren (NLR) sind cytosolische und reagieren auf ein breites Spektrum von PAMPs und dämpft. Nod-like-Rezeptoren wiederpräsentieren eine zweite Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger, die Zelloberfläche und endozytischen PRRs entziehen. Das Zusammenspiel der Erreger stammt, oder "Gefahr" verbunden sind, Faktoren, die mit TLR-Liganden und NLR führt zu einem Zustand der DC-Reifung zu erhöhten DC Interaktion mit anderen Immunzellen und die Förderung der T-Zell-und Zell-Aktivierung natürlicher Killer 11.
Interleukin-1β ist ein entscheidender Bestandteil der Immunabwehr gegen Infektionen. Bei Erkennen eines Mikroorganismus, der hoch proinflammatorische Cytokin IL-1β, wird sezerniert und wirkt als ein chemo Lockstoff und Aktivator der angeborenen und erworbenen Immunzellen. In vivo IL-1β ist weitgehend für die Akutphasenreaktion, einschließlich Fieber und inflammatorischen Cytokins verantwortlich 12 Synthese.
Die meisten NLRs enthalten eine C-terminale Leucin-reichen Repeat-Domäne, das vermutlich in der Ligandenerkennung, einem zentralen Nukleotid-Bindungsdomäne (NACHT), die impo ist funktionierenrtant für NLRP3 Oligomerisierung und einer N-terminalen Effektor-Domäne (PYD in NLRP3), die Signaltransduktion vermittelt den nachgeschalteten Ziele durch Protein-Protein-Interaktionen. Die NLRP3 Protein definiert den am intensivsten untersuchten Inflammasom komplex. Dieses Protein ist ein Mitglied der Familie NLR und hat die Fähigkeit, eine Mehrmolekularproteinkomplex NLRP3, Adaptorproteins PYCARD (auch bekannt als ASC) und ICE zusammen bilden. Nach Aktivierung Inflammasom PYCARD bindet an NLRP3 N-terminalen Domänen und rekrutiert ICE über Caspase-Aktivierung und Rekrutierung Domäne (CARD)-Domänen. Interleukin-1-Converting-Enzym wird anfänglich als ein Zymogen, das eine CARD-Motiv am N-Terminus erzeugt wird. Inflammasom Bildung führt zu bringen zwei ICE-Moleküle nahe genug, um ihre autokatalytische Aktivierung zu induzieren. Das Inflammasom Komplex ist für die Aktivierung ICE so dass es zytoplasmatischen Pro-IL-1β umwandeln Zytokin reifen erforderlich.
Erfolgreiche Sekretion von IL-1β in DCs erfordert Nachweis von zwei verschiedenen und unabhängigen Gefahrensignale. Zunächst TLR Erkundung von PAMPs, dämpft oder Cytokine Signaling (TNF oder IL-1β) bewirkt eine Hochregulation von Zytoplasma-Pro-IL-1β-Protein-Expression. Für Inflammasom Komplexbildung vor der ICE Reifung Eine zweite, oft anders, Signal erforderlich. Ein paar Inflammasom stimulierende Signale sind bakterielle Membran porenbildende Toxine (wie Nigericin), lysosomale stören Kristalle (wie Mononatriumuratkristallen, MSU) und extrazelluläre ATP. Der Upstream-Mechanismus, der zu Inflammasom Aktivierung durch diese unterschiedlichen Aktivatoren NLRP3 ist unklar. Studien, die vor der Signal Inflammasom Bildung schlägt vor, dass die intrazelluläre Ereignisse, wie die Induktion von Hypokaliämie oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die indirekt 13-28 Inflammasom aktivieren.
Unter den verschiedenen virale Aktivatoren des NLRP3 Inflammasom ist Influenza, die b bietetoth die Primär-und Sekundärsignal für IL-1β Sekretion 3, 29-33 erforderlich. Mit der Maus NLRP3 Knockout-Modelle wurde gefunden, dass IL-1β-Sekretion in DCs ist abhängig NLRP3 32. Zusätzlich zog NLRP3 Knockout-Mäuse weniger Leukozyten an den Ort der Infektion und erfahrenen höhere Mortalität 2, 5. Zwei neuere Arbeiten legen nahe, einen Mechanismus für die NLRP3 Inflammasom Aktivierung während der Influenza-Virus-Infektion; erste, Grundieren durch Erkennung der viralen RNA durch TLR7 oder TLR8 (abhängig von TLR-Expression der Zelle reagiert) oder durch Erfassung von kommensalen Bakterien von anderen TLR zytoplasmatische Pro-IL-1β-Expression zu induzieren, gefolgt von einem zweiten Signal, die Aktivierung von NLRP3 Inflammasom Bildung durch virale Ionenkanalproteins M2 auf dem trans-Golgi-Netzwerk 33, 34. Im letzten Schritt, die Auslösung des NLRP3 Inflammasom ist durch eine Störung der intrazellulären Ionen erreicht <em> Milieu führt zu ROS-Produktion, das ist einfach, durch NLPR3 als Signal an die Inflammasom bilden erfaßt. Doch der genaue Mechanismus der Aktivierung Inflammasom vor der ICE-Aktivität während der Influenza-Infektion noch unklar.
Diese Arbeit beschreibt eine Technik, wertvoll für das Studium der NLRP3 Inflammasom im menschlichen MoDCs, die als Grundlage für die weitere Untersuchung der zugrunde liegenden Weg DC basierend IL-1β-Sekretion in Reaktion auf TLR8 Ligation mit R848, gefolgt von der Aktivierung des Inflammasom von einem gut genutzt werden kann bekannt Aktivator der NLRP3, Nigericin. Variationen dieses Verfahrens können mit anderen Zelltypen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Monozyten, Makrophagen, anderen DC Untergruppen und Epithelzellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inflammatorische Zytokine sind integrale bei der Steuerung der angeborenen und adaptiven Immunantwort auf Virusinfektion zu kämpfen. Sezernierte IL-1β wurde gezeigt, dass während der Influenza-Infektion 3, 43, 44 zu erhöhen. Die genauen Mechanismen, durch die diese Zytokine werden als Reaktion auf Viruserkennung in menschlichen dendritischen Zellen nicht vollständig verstanden. Myeloische DC-Isolierungs-Kits sind teuer und zeitaufwendig. Isolation Kits und FAC Sortierung kann unbeabsichtigt Stress oder a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., und Meagan O'Brien, MD für ihre Unterstützung und Rückmeldung zu quittieren. Diese Forschung wurde durch das Nationale Institut für Allergie-und Infektionskrankheiten unterstützt und mit Mitteln aus NIH gewährt Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards für Individual Fellowships Predoctoral (F31), um Vielfalt in der Gesundheitsforschung (AI089030) und RO1 (AI081848 Förderung abgeschlossen ).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12-well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96-well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12 % polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| α-CD11c | BD | 555392 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol – 4L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P-36931 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
References
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., & Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine.. 210, 503-516, doi:10.1084/jem.20121897 (2013).
- Thomas, P. G. et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity.. 30, 566-575, doi:10.1016/j.immuni.2009.02.006 (2009).
- Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., & Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology.. 79, 6441-6448, doi:10.1128/JVI.79.10.6441-6448.2005 (2005).
- Pang, I. K., Ichinohe, T., & Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol.. 14, 246-253, doi:10.1038/ni.2514 (2013).
- Allen, I. C. et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity.. 30, 556-565, doi:10.1016/j.immuni.2009.02.005 (2009).
- Bauernfeind, F. G. et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol.. 183, 787-791, doi:10.4049/jimmunol.0901363 (2009).
- Zabel, F., Kundig, T. M., & Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology., doi:10.1016/j.coviro.2013.05.004 (2013).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine.. 13, 1155-1159, doi:10.1038/nm1643 (2007).
- Bhardwaj, N. et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation.. 94, 797-807, doi:10.1172/JCI117399 (1994).
- Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., & Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery.. 2013, 516749, doi:10.1155/2013/516749 (2013).
- Pohl, C., Shishkova, J., & Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology.. 9, 279-289, doi:Doi 10.1111/J.1462-5822.2006.00863.X (2007).
- Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol.. 216, 133-165 (1996).
- Petrilli, V. et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation.. 14, 1583-1589, doi:10.1038/sj.cdd.4402195 (2007).
- Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., & Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology.. 38, 312-320, doi:10.1016/j.dci.2012.06.004 (2012).
- Rajamaki, K. et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry.. 288, 13410-13419, doi:10.1074/jbc.M112.426254 (2013).
- Ayna, G. et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One 7, e40069, doi:10.1371/journal.pone.0040069 (2012).
- Vyleta, M. L., Wong, J., & Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One.. 7, e36044, doi:10.1371/journal.pone.0036044 (2012).
- Lacroix-Lamande, S. et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol.. 188, 2805-2814, doi:10.4049/jimmunol.1101987 (2012).
- Segovia, J. et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One.. 7, e29695, doi:10.1371/journal.pone.0029695 (2012).
- Hamon, M. A., & Cossart, P. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity.. 79, 2839-2846, doi:10.1128/IAI.01243-10 (2011).
- Schorn, C. et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry.. 286, 35-41, doi:10.1074/jbc.M110.139048 (2011).
- Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., & Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One.. 5, e10008, doi:10.1371/journal.pone.0010008 (2010).
- Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., & Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry.. 285, 10508-10518, doi:10.1074/jbc.M109.067298 (2010).
- Chu, J. et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology.. 86, 1227-1238, doi:10.1189/jlb.0309164 (2009).
- Silverman, W. R. et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry.. 284, 18143-18151, doi:10.1074/jbc.M109.004804 (2009).
- Piccini, A. et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A.. 105, 8067-8072, doi:10.1073/pnas.0709684105 (2008).
- Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., & Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology.. 10, 332-343, doi:10.1111/j.1462-5822.2007.01044.x (2008).
- Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., & Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry.. 282, 18810-18818, doi:10.1074/jbc.M610762200 (2007).
- Owen, D. M., & Gale, M., Jr. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity.. 30, 476-478, doi:10.1016/j.immuni.2009.03.011 (2009).
- Pang, I. K., & Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology.. 32, 34-41, doi:10.1016/j.it.2010.11.004 (2011).
- Kanneganti, T. D. et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry.. 281, 36560-36568, doi:10.1074/jbc.M607594200 (2006).
- Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., & Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine.. 206, 79-87, doi:10.1084/jem.20081667 (2009).
- Ichinohe, T., Pang, I. K., & Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol.. 11, 404-410, doi:10.1038/ni.1861 (2010).
- Ichinohe, T. et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A.. 108, 5354-5359, doi:10.1073/pnas.1019378108 (2011).
- O'Neill, D. W., & Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. Chapter 22, Unit 22F 24, doi:10.1002/0471142735.im22f04s67 (2005).
- Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), e50085, doi:10.3791/50085 (2013).
- Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., & Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal.. 9, 1503-1510 (1990).
- Ritchie, H., & Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research.. 242, 439-450, doi:10.1006/excr.1998.4118 (1998).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., & Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols.. 1, 1507-1516, doi:10.1038/nprot.2006.268 (2006).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp.. 38, doi:10.3791/1743 (2010).
- Mahmood, T., & Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences.. 4, 429-434, doi:10.4103/1947-2714.100998 (2012).
- Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., & Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology.. 463, 573-599, doi:10.1016/S0076-6879(09)63033-0 (2009).
- Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., & Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol.. 149, 932-939 (1992).
- Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., & Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol.. 162, 7322-7329 (1999).
- Anderson, J., Gustafsson, K., & Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology.. 9, 259-266,doi:10.3109/1547691X.2012.685528 (2012).
- Waithman, J., & Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence.. 3, 603-608, doi:10.4161/viru.21864 (2012).
