सक्रियण और मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं में आईएल 1β का प्रयोग NLRP3 inflammasome गतिविधि की माप

Summary

वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) nigericin साथ NLRP3 inflammasome सक्रियण द्वारा पीछा सिंथेटिक प्यूरीन, R848 के TLR8 मान्यता, के जवाब में आईएल 1β छिपाना, इसलिए, आईएल 1β NLRP3 inflammasome गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Intracellular साइटोकाइन धुंधला हो जाना, immunoblotting, और एलिसा सही आईएल 1β अभिव्यक्ति के माध्यम से NLRP3 भड़काना inflammasome और सक्रियण को मापने के लिए किया जाता है.

Abstract

इंटरल्युकिन का स्राव (आईएल) से उत्पन्न सूजन प्रक्रियाओं -1 प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा परिवार साइटोकिन्स स्थानीय या प्रणालीगत सूजन, ऊतक remodeling और मरम्मत, और virologic नियंत्रण ^{1, 2} के लिए नेतृत्व. इंटरल्युकिन 1β सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक अनिवार्य तत्व है और लगातार संक्रमण ^1-5 की स्थापना को रोकने जबकि रोगजनकों हमलावर को खत्म करने के लिए योगदान देता है.

Inflammasomes 1 परिवर्तित एंजाइम (बर्फ या कस्पासे 1) इंटरल्यूकिन के क्रियान्वयन के लिए महत्वपूर्ण संकेत मंच हैं. NLRP3 inflammasome आईएल 1β स्राव ⁶ पैदा करने के लिए DCs में कम से कम दो संकेतों की आवश्यकता है. समर्थक आईएल 1β प्रोटीन अभिव्यक्ति कोशिकाओं आराम में सीमित है; इसलिए एक भड़काना संकेत आईएल 1β प्रतिलेखन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है. बहु – प्रोटीन NLRP3 inflammasome के गठन में NLRP3 परिणामों से लगा एक दूसरा संकेत. जिम्मेदारी को वृक्ष के समान कोशिकाओं की क्षमताआईएल 1β स्राव के लिए आवश्यक संकेतों को डी बैक्टीरियल विष के साथ NLRP3 inflammasome के सक्रियण द्वारा पीछा प्रधानमंत्री कोशिकाओं को वृक्ष के समान कोशिकाओं (moDCs) व्युत्पन्न मानव monocyte में TLR8 द्वारा महसूस किया जाता है जो एक कृत्रिम प्यूरीन, R848, का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है पोटेशियम ionophore, nigericin.

Monocyte व्युत्पन्न DCs आसानी संस्कृति में उत्पादित और विशुद्ध मानव माइलॉयड DCs की तुलना में काफी अधिक कोशिकाओं को प्रदान कर रहे हैं. यह बजाय व्युत्पन्न माउस की, DCs इस प्रकार मानव रोग और संक्रमण में inflammasome के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, इन विट्रो मानव में उपयोग करता है में यहाँ प्रस्तुत विधि अन्य inflammasome assays से अलग है.

Introduction

सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के सक्रियण संक्रमण, बीमारी, और टीकाकरण के दौरान ⁷ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संचालित करने के लिए आवश्यक है. वृक्ष के समान कोशिकाओं सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं को पेश सबसे शक्तिशाली प्रतिजन होते हैं; वे एंटीजन का तेज, लिम्फ नोड्स में प्रवास, और भोले सीडी 4 ⁺ और ​​cytolytic सीडी 8 ⁺ टी कोशिकाओं ^8-10 के क्रियान्वयन के लिए विशेष कर रहे हैं. तेजी से रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए सक्षम करने के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रणाली संरक्षित रोगज़नक़ व्युत्पन्न रूपांकनों या सेल तनाव और नुकसान का मेजबान व्युत्पन्न मार्करों मानते हैं कि कई germline इनकोडिंग पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRR) का इस्तेमाल करता है. रिसेप्टर्स (TLRs) की तरह टोल कुछ बाह्य phagocytized रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) और खतरे जुड़े आणविक पैटर्न (damps) समझते हैं कि झिल्ली बाध्य पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स हैं. रिसेप्टर्स (NLRs) की तरह विपरीत इशारा करके साइटोसोलिक हैं और PAMPs और damps की एक विविध रेंज का जवाब. रिसेप्टर्स पुन मंजूरीकोशिका की सतह और endocytic PRRs बचने कि रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की एक दूसरी पंक्ति मौजूद. व्युत्पन्न रोगज़नक़, या "खतरे" की बातचीत, जुड़े TLR और NLR ligands के साथ कारकों अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं और टी सेल और प्राकृतिक हत्यारा सेल सक्रियण ¹¹ की पदोन्नति के साथ वृद्धि हुई डीसी बातचीत में जिसके परिणामस्वरूप डीसी परिपक्वता का एक राज्य की ओर जाता है.

इंटरल्युकिन 1β संक्रमण के खिलाफ मेजबान बचाव का एक महत्वपूर्ण घटक है. एक सूक्ष्मजीव की मान्यता पर, अत्यधिक proinflammatory साइटोकाइन, आईएल 1β, secreted है और एक chemo attractant और सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता है. में vivo आईएल 1β बुखार और भड़काऊ साइटोकाइन सहित तीव्र चरण प्रतिक्रिया के लिए काफी हद तक जिम्मेदार है संश्लेषण ^12.

अधिकांश NLRs ligand संवेदन, जन्मदिन है कि एक केंद्रीय न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी डोमेन (Nacht) में कार्य करने के लिए सोचा है कि एक सी टर्मिनल leucine संपन्न दोहराने डोमेन होते हैंNLRP3 oligomerization, और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के माध्यम से बहाव के लक्ष्यों को संकेत पारगमन mediates कि एक एन टर्मिनल प्रेरक डोमेन (NLRP3 में PYD) के लिए rtant. NLRP3 प्रोटीन सबसे अधिक तीव्रता का अध्ययन inflammasome जटिल परिभाषित करता है. इस प्रोटीन NLR परिवार का एक सदस्य है और NLRP3, (भी ए एस सी के रूप में जाना जाता है) एडाप्टर प्रोटीन PYCARD, और बर्फ से बना एक बहु आणविक प्रोटीन जटिल बनाने की क्षमता है. Inflammasome सक्रियण पर PYCARD NLRP3 एन टर्मिनल डोमेन को बांधता है और कस्पासे सक्रियण और भर्ती डोमेन (कार्ड) डोमेन के माध्यम से बर्फ रंगरूटों. इंटरल्युकिन -1 परिवर्तित एंजाइम शुरू में अपनी एन टर्मिनस पर एक कार्ड आकृति युक्त zymogen के रूप में उत्पन्न होता है. दो बर्फ अणुओं लाने में inflammasome गठन परिणाम पर्याप्त करीब उनके autocatalytic सक्रियण प्रेरित करने के लिए. inflammasome जटिल यह साइटोकाइन परिपक्व करने के लिए cytoplasmic समर्थक आईएल 1β कन्वर्ट करने के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार बर्फ को सक्रिय करने के लिए आवश्यक है.

आईएल के सफल स्राव-1β DCs में दो अलग और स्वतंत्र खतरे का संकेत है की संवेदन की आवश्यकता है. सबसे पहले, PAMPs, damps, या साइटोकाइन संकेतन (TNFα या आईएल 1β) की TLR संवेदन cytoplasmic समर्थक आईएल 1β प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक upregulation का कारण बनता है. एक दूसरा, अक्सर अलग, संकेत बर्फ परिपक्वता के अपस्ट्रीम inflammasome जटिल गठन के लिए आवश्यक है. संकेत उत्तेजक कुछ inflammasome बैक्टीरियल झिल्ली ताकना (जैसे nigericin के रूप में) के गठन जहर, (जैसे मोनोसोडियम यूरेट क्रिस्टल, MSU के रूप में) lysosomal में खलल न डालें क्रिस्टल, और बाह्य एटीपी शामिल हैं. इन विविध activators द्वारा inflammasome सक्रियण NLRP3 के लिए अग्रणी नदी के ऊपर तंत्र स्पष्ट नहीं है. Inflammasome गठन का संकेत नदी के ऊपर जांच के अध्ययन ऐसे hypokalemia के शामिल होने या प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के रूप में intracellular घटनाओं, परोक्ष रूप से inflammasome ^13-28 सक्रिय करने का प्रस्ताव है कि.

NLRP3 inflammasome के विभिन्न वायरल activators बीच ख प्रदान करता है जो इन्फ्लूएंजा, हैआईएल 1β स्राव ^{3, 29-33} के लिए आवश्यक प्राथमिक और माध्यमिक संकेत अन्य संगठनों के. माउस NLRP3 पीटकर मॉडल का उपयोग कर यह DCs में आईएल 1β स्राव ³² NLRP3 निर्भर है कि पाया गया था. इसके अतिरिक्त, NLRP3 पीटा चूहों संक्रमण की साइट के लिए कम leukocytes आकर्षित किया है और उच्च मृत्यु दर ^{2, 5} का अनुभव किया. दो हाल के कागजात इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण के दौरान NLRP3 inflammasome सक्रियण के लिए एक तंत्र का सुझाव; पहला, एक दूसरा संकेत द्वारा पीछा cytoplasmic समर्थक आईएल 1β अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए TLR7 या TLR8 (प्रत्युत्तर देना सेल की TLR अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है) द्वारा या अन्य TLRs द्वारा खानेवाला बैक्टीरिया की संवेदन के माध्यम से वायरल शाही सेना, NLRP3 की सक्रियता की मान्यता के माध्यम से भड़काना ट्रांस Golgi नेटवर्क ^{33, 34} पर वायरल आयन चैनल प्रोटीन M2 द्वारा inflammasome गठन. बाद के चरण में, NLRP3 inflammasome के ट्रिगर intracellular आयनिक की अशांति से पूरा होता है <उन्हें> inflammasome के लिए फार्म का एक संकेत के रूप में NLPR3 द्वारा महसूस किया, बस, जो आरओएस उत्पादन के लिए अग्रणी परिवेश. हालांकि, इन्फ्लूएंजा संक्रमण के दौरान बर्फ गतिविधि का inflammasome सक्रियण नदी के ऊपर की सटीक व्यवस्था अभी भी अस्पष्ट बनी हुई है.

इस काम के लिए एक अच्छी तरह से inflammasome के सक्रियण द्वारा पीछा R848 साथ TLR8 बंधाव के जवाब में स्थित डीसी अंतर्निहित मार्ग आईएल 1β स्राव की आगे की जांच के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि मानव moDCs में NLRP3 inflammasome के अध्ययन के लिए मूल्यवान एक तकनीक का वर्णन NLRP3 के ज्ञात उत्प्रेरक, nigericin. इस विधि के बदलाव सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया है, लेकिन सीमित नहीं किया जा सकता है: monocytes, मैक्रोफेज, अन्य डीसी सबसेट, और उपकला कोशिकाओं.

Protocol

आचार वक्तव्य: अनुसंधान के नमूने प्राप्त और दानदाताओं की सहमति के साथ अनुसंधान के लिए जमा हो जाती है. सभी नमूनों कोडित या उपयोग करने से पहले गुमनाम जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल हमारे संस्थागत समीक्षा बोर्ड …

Representative Results

इन तकनीकों में R848 के साथ भड़काना TLR8 उपाय. CD11c + moDCs – समर्थक आईएल 1β के लिए intracellular साइटोकाइन धुंधला CD14 से माइक्रोस्कोपी और FACS readouts के लिए अनुमति देता है. दोनों तकनीकों एक primed गैर, या विश्राम, सेल नियंत्रण के सा…

Discussion

भड़काऊ साइटोकिन्स वायरल संक्रमण से लड़ने के लिए सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया स्टीयरिंग में अभिन्न हैं. स्रावित आईएल 1β इन्फ्लूएंजा संक्रमण ^{3, 43, 44} के दौरान वृद्धि दर्ज की गई है. इन साइटोकिन?…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12-well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96-well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12 % polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
α-CD11c	BD	555392
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
Gentamicin	Invitrogen	15750060
Hepes	Invitrogen	15630080
goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol – 4L	Fisher Scientific	A433P-4
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P-36931
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707