Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all'attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

Summary

Le cellule dendritiche (DC) secernono IL-1β in risposta al riconoscimento di TLR8 purinico sintetico, R848, seguita dall'attivazione inflammasome NLRP3 con nigericin, dunque, IL-1β può essere utilizzata per misurare l'attività inflammasome NLRP3. Intracellulare colorazione citochina, immunoblotting, ELISA e sono utilizzati per misurare con precisione NLRP3 inflammasome adescamento e l'attivazione tramite l'espressione di IL-1β.

Abstract

Processi infiammatori derivanti dalla secrezione di interleuchina (IL) -1 citochine famiglia di cellule immunitarie portano a infiammazione locale o sistemica, rimodellamento tissutale e riparazione, e il controllo virologico ^{1, 2.} L'interleuchina-1β è un elemento essenziale della risposta immunitaria innata e contribuisce ad eliminare agenti patogeni invasori evitando la creazione di infezione persistente ^1-5.

Inflammasomes sono la piattaforma chiave di segnalazione per l'attivazione di interleuchina 1 enzima di conversione (ICE o caspasi-1). Il inflammasome NLRP3 richiede almeno due segnali in DC per provocare la secrezione di IL-1β ^6. Espressione proteica Pro-IL-1β è limitato in cellule quiescenti; Pertanto è richiesto un segnale di innesco per IL-1β trascrizione e l'espressione della proteina. Un secondo segnale rilevato dai risultati NLRP3 nella formazione del multi-proteina NLRP3 inflammasome. La capacità delle cellule dendritiche di responsabilitàd per i segnali necessari per la secrezione di IL-1β può essere testato utilizzando un purinico sintetico, R848, che è rilevata da TLR8 in monociti umana derivata cellule dendritiche (moDCs) di cellule primarie, seguita da attivazione del inflammasome NLRP3 con la tossina batterica e ionophore potassio, nigericin.

Monociti DC derivati ​​vengono facilmente prodotte nella cultura e forniscono significativamente più cellule purificate di cellule dendritiche mieloidi umane. Il metodo qui presentato differisce da altri saggi inflammasome dal fatto di utilizzare in vitro umana, invece di topo derivata, DC permettendo così lo studio della inflammasome nella malattia umana e infezione.

Introduction

L'attivazione del sistema immunitario innato è necessario per orientare le risposte immunitarie adattative durante l'infezione, la malattia, e la vaccinazione ^7. Le cellule dendritiche sono le più potenti cellule presentanti l'antigene del sistema immune innato; sono specializzati per l'assorbimento di antigeni, la migrazione ai linfonodi, e l'attivazione di ingenuo CD4 ⁺ e CD8 ⁺ citolitica cellule T ^8-10. Per attivare il rilevamento rapido patogeno il sistema immunitario innato utilizza numerosi germinali codificato pattern recognition recettori (PRR), che riconoscono patogeni conservati motivi derivati ​​o ospitano derivata marcatori di stress e danno cellulare. Toll like receptors (TLR) sono recettori di membrana legato pattern recognition che riconoscono certi extracellulare patogeno fagocitato pattern molecolari associati (PAMPs) e modelli molecolari pericolo associato (smorza). Per cenno contrario like receptors (NLRs) sono citosolico e rispondere ad una vasta gamma di PAMPs e smorza. Nod like receptors representare una seconda linea di difesa contro gli agenti patogeni che eludono superficie cellulare e PRRs endocitiche. L'interazione del patogeno derivata o "pericolo" associata, fattori con TLR e NLR ligandi porta ad uno stato di maturazione delle DC conseguente maggiore interazione DC con altre cellule immunitarie e promozione della cellula T e l'attivazione delle cellule natural killer ^11.

L'interleuchina-1β è una componente cruciale della difesa dell'ospite contro le infezioni. All'atto della rilevazione di un microrganismo, la citochina proinfiammatoria molto, IL-1β, è secreta e funziona come un attrattivo chemio e attivatore delle cellule immunitarie innate e adattative. In vivo IL-1β è in gran parte responsabile della risposta di fase acuta tra cui febbre e citochine infiammatorie sintesi ^12.

La maggior parte NLRs contengono un dominio ricco di ripetizione C leucina terminale che è pensato per funzionare in sensing ligando, un nucleotide dominio di legame centrale (NACHT), che è imponella documentazione, per NLRP3 oligomerizzazione, ed un terminale di dominio effettore N (PYD in NLRP3) che media la trasduzione del segnale a bersagli a valle attraverso interazioni proteina proteina. La proteina NLRP3 definisce il complesso più intensamente studiati inflammasome. Questa proteina è un membro della famiglia NLR e ha la capacità di formare un complesso proteico molecolare più composto NLRP3, il PYCARD proteina adattatore (noto anche come ASC), e ICE. Dopo l'attivazione inflammasome PYCARD si lega ai domini terminali NLRP3 N e recluta ICE, attraverso l'attivazione delle caspasi e il dominio di reclutamento (CARD) domini. Interleuchina-1 enzima di conversione viene inizialmente generato come zimogeno contenente un motivo CARD al suo N-terminale. Risultati formazione inflammasome nel portare due molecole ICE sufficientemente vicino per indurre la loro attivazione autocatalitica. Il complesso inflammasome necessari all'attivazione ICE permettendo così di convertire citoplasmatica pro-IL-1β maturare citochina.

La secrezione di successo di IL-1β in DC richiede rilevamento di due segnali di pericolo diversi e indipendenti. Primo, TLR rilevamento di PAMPs, smorza o segnalazione citochine (TNFa o IL-1β) causa un upregulation dell'espressione della proteina pro-IL-1β citoplasmatica. È necessaria una seconda, spesso diversi, segnale per inflammasome formazione del complesso monte di ICE maturazione. Alcuni inflammasome segnali di stimolare includono le tossine membrana batterica formazione di pori (come nigericin), lisosomiali interrompendo cristalli (come ad esempio cristalli di urato monosodico, MSU), e ATP extracellulare. Il meccanismo che porta a monte NLRP3 attivazione inflammasome da questi diversi attivatori è chiaro. Gli studi che indagano monte segnalazione della formazione inflammasome propone di eventi intracellulari, come l'induzione di ipopotassiemia o di specie reattive dell'ossigeno (ROS) indirettamente attivano il inflammasome ^13-28.

Tra i diversi attivatori virali del inflammasome NLRP3 è influenza, che fornisce bOth il segnale primario e secondario richiesto per la secrezione di IL-1β ^{3, 29-33.} Utilizzando modelli NLRP3 topo knockout è stato trovato che la secrezione di IL-1β in DC è NLRP3 dipendente ^32. Inoltre, NLRP3 topi knockout attratti minor numero di leucociti nel sito di infezione e sperimentato una maggiore mortalità ^{2, 5.} Due lavori recenti suggeriscono un meccanismo per l'attivazione inflammasome NLRP3 durante l'infezione da virus influenzale; prima, adescamento attraverso il riconoscimento di RNA virale da TLR7 o TLR8 (seconda espressione TLR della cellula risponde) o tramite rilevamento di batteri commensali da altri TLR per indurre l'espressione citoplasmatica pro-IL-1β, seguito da un secondo segnale, l'attivazione di NLRP3 formazione inflammasome da proteine ​​canale ionico M2 virale sulla rete transeuropea Golgi ^{33, 34.} In quest'ultima fase, l'attivazione del inflammasome NLRP3 è compiuto da disturbi del ionico intracellulare <em> ambiente che porta alla produzione di ROS, che è semplice, rilevata da NLPR3 come segnale per formare il inflammasome. Tuttavia, il meccanismo preciso di inflammasome monte l'attivazione di attività ICE durante l'infezione influenzale rimane ancora poco chiaro.

Questo lavoro descrive una tecnica utile per studiare la inflammasome NLRP3 in moDCs umani che può essere utilizzato come base per ulteriori indagini della via sottostante DC basato secrezione di IL-1β in risposta a TLR8 legatura con R848 seguita dall'attivazione del inflammasome da un pozzo attivatore noto di NLRP3, nigericin. Variazioni di questo metodo possono essere utilizzati con altri tipi di cellule inclusi, ma non limitati a: monociti, macrofagi, altri sottoinsiemi DC e cellule epiteliali.

Protocol

Dichiarazione Etica: i campioni di ricerca sono ottenuti e conservati per la ricerca con il consenso dei donatori. Tutti i campioni devono essere codificati o anonimizzati prima dell'uso. Questo protocollo segue le linee guida del nostro Institutional Review Board. 1. Differenziazione del sangue periferico umano monociti in cellule dendritiche derivate da monociti. Nota: buffy coat umani servono come fonte di cellule umane del sangue periferico (PBMC) e sono st…

Representative Results

Queste tecniche misurano TLR8 adescamento con R848. Intracellulare colorazione citochina per pro-IL-1β permette di microscopia e FAC letture da CD14 – CD11c + moDCs. Entrambe le tecniche possono essere quantificate rispetto ad un non innescato, o di riposo, controllo delle cellule così come un controllo isotipico (figure 1 e 2). Percentuale di cellule pro-IL-1β + colorazione viene moltiplicato per il mediano geometrico di questa popolazione per fornire l'intensit?…

Discussion

Citochine infiammatorie sono parte integrante nel guidare la risposta immunitaria innata e adattativa per combattere le infezioni virali. Secreto IL-1β è stato dimostrato di aumentare durante l'infezione influenzale ^{3, 43, 44.} I meccanismi precisi con cui queste citochine sono elaborate in risposta al riconoscimento virale in cellule dendritiche umane non sono pienamente compresi. Kit di isolamento DC mieloidi sono costose e richiedono tempo. Kit di isolamento e FAC ordinamento possono involontariamente…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12-well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96-well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12 % polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
α-CD11c	BD	555392
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
Gentamicin	Invitrogen	15750060
Hepes	Invitrogen	15630080
goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol – 4L	Fisher Scientific	A433P-4
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P-36931
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707