ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定
Summary
樹状細胞（DC）は、ニゲリシンとNLRP3ソーム活性化に続いて、合成プリン、R848のTLR8認識に応答してIL-1βを分泌し、したがって、IL-1βはNLRP3ソーム活性を測定するために使用することができる。細胞内サイトカイン染色、イムノブロッティング、およびELISAを正確にIL-1βの発現を介してNLRP3ソームプライミングおよび活性化を測定するために使用される。
Abstract
インターロイキン（IL）の分泌によって生じる炎症過程-1ファミリーのサイトカインの免疫細胞による組織リモデリングおよび修復、局所または全身性炎症につながる、とウイルス学的コントロール1、2。インターロイキン-1βは、自然免疫応答の重要な要素であり、持続感染1-5の確立を防止しながら、侵入する病原体を排除するために貢献しています。
ソームは1変換酵素（ICEまたはカスパーゼ1）、インターロイキンの活性化のための重要なシグナル伝達プラットフォームである。 NLRP3ソームは、IL-1β分泌6を起こしたDCに少なくとも2つの信号を必要とする。プロIL-1βタンパク質の発現は、休止細胞に限定される;従ってプライミング信号がIL-1βの転写およびタンパク質発現のために必要とされる。多タンパク質NLRP3ソームの形成にNLRP3結果によって感知された第二の信号。責任への樹状細胞の能力IL-1βの分泌に必要な信号をDが細菌毒素とNLRP3ソームの活性化に続いて首相細胞への樹状細胞（のMoDC）を誘導されたヒト単球にTLR8によって感知される合成プリン、R848を用いて試験することができ、カリウムイオ、ナイジェリシン。
単球由来DCは簡単に培養中に生産され、精製されたヒト骨髄性樹状細胞よりもはるかに多くの細胞を提供している。それは代わりにマウス由来の、樹状細胞は、このように人間の病気や感染症におけるソームの研究を可能にし、in vitroでヒトにおいて使用することをここで紹介する方法は、他のソームアッセイとは異なります。
Introduction
先天性免疫系の活性化は、感染、疾患、およびワクチン接種7の間に適応免疫応答を操縦する必要がある。樹状細胞は、自然免疫系の細胞に提示する最も強力な抗原であり;これらは、抗原の取り込み、リンパ節への移行、およびナイーブCD4 +およびCD8 +細胞溶解性T細胞の活性化を8-10に特化されている。迅速な病原体の検出を可能にするために、自然免疫系は、保存病原体に由来するモチーフまたは細胞ストレスおよび損傷のホスト派生マーカーを認識し、多数の生殖細胞系列符号化されたパターン認識受容体（PRR）を利用する。受容体（TLR）Toll様は、特定の細胞外貪食病原体関連分子パターン（PAMP）と危険の関連分子パターン（減衰）を認識膜結合パターン認識受容体である。受容体（NLRs）のようなコントラストのNODによって細胞質ゾルであり、のPAMPおよび減衰の多様な範囲に対応しています。受容体が再うなずく細胞表面とエンドサイトーシスPRRSを回避病原体に対する防御の2行を提示する。由来の病原体、または関連する「危険性」の相互作用は、TLRとNLR配位子を有する因子は、他の免疫細胞とT細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化11の推進と増加したDCとの相互作用を生じるDC成熟の状態に至る。
インターロイキン-1βは、感染に対する宿主防御の重要なコンポーネントです。微生物の認識に、高度に炎症性サイトカインIL-1βは、分泌され、化学誘引し、自然免疫と獲得免疫細胞の活性化因子として機能する。 インビボ IL-1βは、発熱や炎症性サイトカインなどの急性期反応の主な原因である合成12。
最もNLRsリガンドセンシング、IMPO中央ヌクレオチド結合ドメイン（NACHT）において機能すると考えられるC末端ロイシンリッチリピート領域を含有するNLRP3のオリゴマー化のためのrtant、およびタンパク質タンパク質相互作用を介して下流の標的へのシグナル伝達を媒介するN末端エフェクタードメイン（NLRP3でPYD）。 NLRP3タンパク質は、最も熱心に研究ソーム複合体を定義しています。このタンパク質は、NLRファミリーのメンバーであり、NLRP3（また、ASCとしても知られる）アダプタータンパク質PYCARD、及びICEの多層高分子タンパク質複合体を形成する能力を有する。ソーム活性化の際にPYCARDはNLRP3 N末端ドメインに結合し、カスパーゼ活性化および動員ドメイン（CARD）ドメインを介して氷を募集しています。インターロイキン-1変換酵素は、最初に、そのN末端CARDモチーフを含む酵素前駆体として生成される。彼らの自己触媒活性化を誘導するのに十分近い2 ICE分子を持って来ることでソーム形成の結果。ソーム複合体は、サイトカイン成熟細胞質プロIL-1βを変換することができ、従ってICEを活性化するために必要である。
イリノイ州の正常な分泌-1βDCにおける、2つの異なる独立した危険信号の検出を必要とします。まず、のPAMP、DAMPS、またはサイトカインシグナル伝達（TNFα又はIL-1β）のTLRの検出は、細胞質プロIL-1βタンパク質発現のアップレギュレーションを引き起こす。第二に、多くの場合、異なる信号を、氷の成熟の上流ソーム複合体形成に必要である。シグナルを刺激するいくつかのソーム（例えばナイジェリシンなど）の毒素、リソソーム撹乱（例えば尿酸一ナトリウム結晶として、MSU）結晶、および細胞外ATPを形成する細菌の膜の孔があります。これらの多様な活性化因子でNLRP3ソームの活性化をもたらす上流メカニズムは不明である。ソーム形成のシグナル伝達の上流を調査研究では、低カリウム血症の誘導や活性酸素種（ROS）のような細胞内イベントは、間接的にソーム13-28を活性化することを提案している。
NLRP3ソームの異なるウイルスの活性化剤の中でBを提供し、インフルエンザ、ですIL-1βの分泌3、29-33のために必要な一次および二次信号をOTH。 NLRP3ノックアウトマウスモデルを用いてそれがDCにおけるIL-1βの分泌が32 NLRP3依存することが見出された。さらに、NLRP3ノックアウトマウスは、感染部位に少ない白血球を集め、より高い死亡率2、5を経験した。二つの最近の論文は、インフルエンザウイルス感染時のNLRP3ソームの活性化のためのメカニズムを示唆している。第一、第二シグナルが続く細胞質プロIL-1β発現を誘導するTLR7またはTLR8（応答細胞のTLR発現に依存する）によって、または他のTLRによる共生細菌の検出を通じてウイルスRNA、NLRP3の活性化の認識を通じてプライミングトランスゴルジ網33、34上のウイルスのイオンチャネルタンパク質M2でソームの形成。後者のステップでは、NLRP3ソームのトリガーは、細胞内のイオンの妨害することによって達成される<EM>ソームを形成するための信号としてNLPR3によって感知され、単純に、あるROS産生につながる環境。しかし、インフルエンザ感染時のICE活動の上流ソーム活性化の正確なメカニズムは依然として不明のままである。
この作品は良くによってソームの活性化に続いてR848とTLR8ライゲーションに応じて、DCベースのIL-1β分泌の基礎となる経路のさらなる調査のための基礎として使用することができ、人間のMoDCにNLRP3ソームを研究するための貴重な技術が記載されているNLRP3の既知の活性化、ナイジェリシン。この方法のバリエーションには、他の細胞型で使用されるが、これらに限定されないことができる：単球、マクロファージ、他のDCサブセット、および上皮細胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
炎症性サイトカインは、ウイルス感染と戦うために、先天性および適応免疫応答を操縦中に一体化されている。分泌されたIL-1βは、インフルエンザ感染症3、43、44の間に増加することが示されている。これらのサイトカインは、ヒト樹状細胞におけるウイルスの認識に応答して処理される正確なメカニズムは完全に理解されていない。骨髄性DC単離キットは、高価で時間がかかる。離?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼らのサポートとフィードバックのためにオリビエManches博士は、Davor Frleta、博士、ミーガン·オブライエン、MDを承認したいと思います。この研究は、アレルギー感染症研究所によってサポートされ、NIHは、健康関連の研究（AI089030）とRO1（AI081848の多様性を促進するために個々の博士号を取得する前のフェローシップ（F31）用ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞を付与からの資金の完了した）。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12-well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96-well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12 % polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| α-CD11c | BD | 555392 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol – 4L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P-36931 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
References
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
- Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
- Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
- Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
- Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
- Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. , (2013).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
- Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
- Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
- Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
- Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
- Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
- Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
- Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
- Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. , (2012).
- Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
- Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
- Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
- Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
- Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
- Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
- Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
- Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
- Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
- Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
- Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
- Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
- Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
- Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
- Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
- Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
- Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
- O’Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
- Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
- Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
- Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
- Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
- Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
- Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
- Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
- Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).
