Aktivisering og måling av NLRP3 Inflammasome aktivitet Bruke IL-1β i Human Monocyte-avledet dendrittiske celler

Summary

Dendrittiske celler (DCS) skiller ut IL-1β som reaksjon på TLR8 anerkjennelse av syntetisk purin, R848, etterfulgt av NLRP3 inflammasome aktivering med nigericin derfor IL-1β kan brukes til å måle NLRP3 inflammasome aktivitet. Intracellulær cytokin farging, immunoblotting, og ELISA brukes til å måle NLRP3 inflammasome grunning og aktivering via IL-1β uttrykk.

Abstract

Inflammatoriske prosesser som følge av utskillelsen av interleukin (IL) -1 familien av cytokiner immunceller fører til lokal eller systemisk inflammasjon, vev-omdanning og reparasjon, og virologisk kontroll ^{1, 2.} Interleukin-1β er et vesentlig element i det medfødte immunforsvaret og bidrar til å eliminere invaderende patogener mens hindre etablering av vedvarende infeksjon ^1-5.

Inflammasomes er nøkkelsignale plattformen for aktivering av interleukin 1-konverterende enzym (ICE eller Caspase-1). Den NLRP3 inflammasome trengs minst to signaler i DCS å forårsake ^IL-6 sekresjon 1β. Pro-IL-1β protein ekspresjon er begrenset i hvilende celler; derfor en tennsignal er nødvendig for IL-1β transkripsjon og proteinekspresjon. Et andre signal som avføles av NLRP3 resulterer i dannelsen av multi-protein NLRP3 inflammasome. Muligheten av dendrittiske celler til ansvard til de signaler som er nødvendige for IL-1β sekresjon kan testes ved hjelp av en syntetisk purin, R848, som blir avfølt av TLR8 i human monocytt avledet dendrittiske celler (moDCs) å prime-celler, etterfulgt av aktivering av NLRP3 inflammasome med bakterielle toksiner og kalium ionophore, nigericin.

Som stammer fra monocytter DCs er lett produsert i kultur og gi betydelig flere celler enn rensede menneske myeloide DCs. Metoden som er presentert her er forskjellig fra andre inflammasome assays ved at den bruker in vitro human, i stedet for mus avledet, DC og dermed gir for studiet av inflammasome i human sykdom og infeksjon.

Introduction

Aktivering av medfødte immunsystemet er nødvendig for å styre adaptive immunresponser under infeksjon, sykdom, vaksinasjon og ^7.. Dendrittiske celler er de mest potente antigenpresenterende celler av det medfødte immunsystemet; de er spesialisert for opptak av antigener, migrasjon til lymfeknuter, og aktivering av naive CD4 ⁺ og cytolytiske CD8 ⁺ T-celler ^8-10. For å muliggjøre rask deteksjon av patogen det medfødte immunsystemet benytter mange germline kodet mønstergjenkjenning reseptorer (PRR) som gjenkjenner konservert patogen avledet motiver eller verts avledet markører for celle stress og skade. Toll like reseptorer (TLR) er membran bundet mønstergjenkjenning reseptorer som gjenkjenner visse ekstracellulære phagocytized patogen assosiert molekylære mønstre (PAMPs) og fare forbundet molekylære mønstre (demper). I motsetning nikk like reseptorer (NLRs) er cytosolic og svare på et variert utvalg av PAMPs og demper. Nikke like reseptorer representere en andrelinjeforsvar mot patogener som unndrar celleoverflaten og endocytiske PRRs. Samspillet av patogen avledet, eller "fare" forbundet, faktorer med TLR og NLR ligander fører til en tilstand av DC modning som resulterer i økt DC samhandling med andre immunceller og fremming av T-celle og natural killer celle aktivering ^11.

Interleukin-1β er en viktig komponent i mange forsvar mot infeksjon. Ved godkjenning av en mikroorganisme, den svært proinflammatoriske cytokiner, IL-1β, utskilles og fungerer som en chemo tiltrekkende og aktivator av medfødte og ervervede immunceller. In vivo IL-1β er i stor grad ansvarlig for den akutte fase respons inkludert feber og inflammatorisk cytokin syntese ^12.

De fleste NLRs inneholde en C-terminal leucine rikt gjenta domene som er tenkt å fungere i ligand sensing, en sentral nucleotide bindende domenet (NACHT) som er important for NLRP3 oligomerization, og en N-terminal effektor domene (PYD i NLRP3) som medierer signaltransduksjon til nedstrøms mål gjennom protein protein interaksjoner. NLRP3 protein definerer de mest intenst studert inflammasome kompleks. Dette proteinet er et medlem av familien NLR og har evnen til å danne et multi molekylproteinkompleks bestående av NLRP3, adapteren protein PYCARD (også kjent som ASC), og is. Ved inflammasome aktivering PYCARD binder seg til NLRP3 I terminal domener og rekrutterer ICE via caspase aktivering og rekruttering domene (kort) domener. Interleukin-1-konverterende enzym blir først generert som et zymogenplasminogen.Plasminogen inneholdende et CARD motiv ved dets N-terminus. Inflammasome dannelsen, resulterer i å bringe to is molekyler tilstrekkelig tett til å indusere deres autokatalytisk aktivering. Den inflammasome kompleks som er nødvendig for aktivering av ICE og dermed tillater det å konvertere cytoplasmisk pro-IL-1β å modne cytokin.

Vellykket sekresjon av IL-1β i DCs krever sensing av to ulike og uavhengige faresignaler. Først, TLR sensing av PAMPs, demper, eller cytokin signalering (TNF-alfa eller IL-1β) fører til en oppregulering av cytoplasmatisk pro-IL-1β protein uttrykk. En annen, ofte annerledes, signal er nødvendig for inflammasome kompleksdannelse oppstrøms for ICE modning. Noen inflammasome stimulerende signaler omfatter bakterielle membran poredannende toksiner (som nigericin), lysosomale forstyrre krystaller (for eksempel mononatrium urat krystaller, MSU), og ekstracellulært ATP. Oppstrøms mekanisme som fører til NLRP3 inflammasome aktivering av disse ulike aktivatorer er uklart. Studier som undersøker signaliserer oppstrøms inflammasome dannelse foreslår at intracellulære hendelser, for eksempel induksjon av hypokalemi eller reaktive oksygenforbindelser (ROS) indirekte aktivere inflammasome ^13-28.

Blant de forskjellige virale aktivatorer av den NLRP3 inflammasome er influensa, som gir bOTH den primære og sekundære signal kreves for IL-1β sekresjon ^{3, 29-33.} Ved hjelp av muse NLRP3 knockout modeller ble det funnet at IL-1β sekresjon i DCs er NLRP3 avhengig ^32. I tillegg NLRP3 knockout mus tilt færre leukocytter til området for infeksjon og opplevde høyere dødelighet ^{2, 5.} To nyere papirer foreslå en mekanisme for NLRP3 inflammasome aktivering under Influensa virus infeksjon; først grunning gjennom anerkjennelse av viralt RNA ved TLR7 eller TLR8 (avhengig TLR ekspresjon av det reagerer celle) eller ved avføling av Commensal bakterier ved andre TLR å indusere cytoplasmisk pro-IL-1β ekspresjon, fulgt av et andre signal, aktivering av NLRP3 inflammasome dannelsen av viral ionekanal protein M2 på trans Golgi nettverk ^{33, 34.} I det sistnevnte trinn, er utløsning av den NLRP3 inflammasome oppnådd ved forstyrrelse av intracellulær ionisk <em> miljø som fører til ROS produksjon, noe som er ganske enkelt, som avføles av NLPR3 som et signal for å danne det inflammasome. Men den nøyaktige virkningsmekanismen inflammasome aktivering oppstrøms ICE aktivitet under influensainfeksjon er fremdeles uklart.

Dette arbeidet beskriver en teknikk verdifullt for å studere NLRP3 inflammasome i menneskelige moDCs som kan brukes som et grunnlag for videre etterforskning av veien underliggende DC basert IL-1β sekresjon i respons til TLR8 ligation med R848 fulgt av aktivering av inflammasome av et godt kjent aktivator av NLRP3, nigericin. Variasjoner av denne fremgangsmåte kan anvendes sammen med andre celletyper, inkludert, men ikke begrenset til, monocytter, makrofager, andre DC-undergrupper, og epitelceller.

Protocol

Etikk Uttalelse: Forsknings prøvene er innhentet og lagret for forskning med givernes samtykke. Alle prøver skal kodes eller anonymisert før bruk. Denne protokollen følger retningslinjene til vår Institutional Review Board. En. Differensiering av humane perifere blod monocytter inn stammer fra monocytter dendrittiske celler. Merk: Menneske buffy coats tjene som kilde til humane perifere blodceller (PBMC) og ble hentet fra New York Blood Center (New York, NY). …

Representative Results

Disse teknikkene måle TLR8 grunning med R848. Intracellulær cytokin farging for pro-IL-1β åpner for mikroskopi og FACS avlesninger fra CD14 – CD11c + moDCs. Begge teknikkene kan kvantifiseres i forhold til en ikke fylt, eller hviler, cellekontroll, så vel som en isotype-kontroll (figur 1 og 2). Prosent av pro-IL-1β + fargings celler er multiplisert med den geometriske midtlinje av denne populasjon for å gi median fluorescensintensitet (MFI). MFI er sammenlignbar m…

Discussion

Inflammatoriske cytokiner er integrert i styre medfødte og adaptive immunrespons til å bekjempe virusinfeksjoner. Utskilt IL-1β har vist seg å øke i løpet av influensainfeksjon ^{3, 43, 44.} De nøyaktige mekanismer som disse cytokiner er bearbeidet som respons på viral anerkjennelse i humane dendritiske celler er ikke fullt ut forstått. Myeloid DC isolasjonssett er kostbare og tidkrevende. Isolasjon kits og FAC sortering kan utilsiktet stress eller aktivere cellene. I tillegg er det ofte utilstrekkelig …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12-well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96-well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12 % polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
α-CD11c	BD	555392
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
Gentamicin	Invitrogen	15750060
Hepes	Invitrogen	15630080
goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol – 4L	Fisher Scientific	A433P-4
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P-36931
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707