Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em> In vitro</em> Modèle de l'AVC
Summary
Nous avons développé un modèle de tranche de cerveau qui peut être utilisé pour examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans les lésions cérébrales excitotoxicité médiée. Cette technique génère tissu cerveau mature viable et réduit le nombre d'animaux nécessaires à l'expérimentation, tout en gardant la circuiterie neuronale, interactions cellulaires, et des compartiments post-synaptiques en partie intact.
Abstract
Examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans les conditions neuropathologiques, tels que l'AVC ischémique, il peut être difficile lors de l'utilisation des systèmes animaux entiers. Comme les systèmes de culture cellulaire »neuronale comme 'tel, primaire ou sont couramment utilisés. Bien que ces systèmes sont relativement faciles à travailler avec, et des systèmes de modèles utiles dans lequel divers résultats fonctionnels (tels que la mort cellulaire) peuvent être facilement quantifiés, les résultats examinés et les voies dans les neurones immatures cultivés (tels que voies de mort cellulaire excitotoxicité médiée) ne sont pas nécessairement les mêmes que ceux observés dans le cerveau mature, ou dans un tissu intact. Par conséquent, il est nécessaire de développer des modèles dans lesquels les mécanismes cellulaires dans les tissus nerveux matures peuvent être examinés. Nous avons mis au point une technique in vitro qui peut être utilisé pour étudier une variété de voies moléculaires dans le tissu nerveux intact. La technique décrite ici utilise le tissu cortical de rat, mais cette technique peut être adapté pour utiliser un tissuà partir d'une variété d'espèces (par exemple, la souris, le lapin, le cochon Guinée, et le poulet) ou des régions du cerveau (par exemple, l'hippocampe, le striatum, etc.) En outre, une variété de stimulations / traitements peut être utilisée (par exemple, excitotoxique, l'administration d'inhibiteurs, etc.) En conclusion, le modèle de tranche de cerveau décrit ici peut être utilisé pour examiner une variété de mécanismes moléculaires impliqués dans les lésions cérébrales excitotoxicité médiée.
Introduction
La forme la plus courante d'AVC est un accident ischémique cérébral, qui se produit quand un vaisseau sanguin cérébral devient occlus. L'ischémie tissulaire qui résulte de l'arrêt de la circulation sanguine provoque une dépolarisation des membranes généralisée, la libération des neurotransmetteurs excitateurs, et une élévation soutenue de calcium intracellulaire, qui conduit à l'activation de la mort cellulaire cheminements de 1. Ce processus a été appelé «excitotoxicité», et est une voie commune impliqué dans la mort neuronale produite par une variété de pathologies, y compris la course 2. L'inhibition des voies de signalisation impliquées dans l'excitotoxicité et autres cascades de mort des cellules neuronales est une approche intéressante pour limiter les dégâts neuronale après un AVC.
Identifier les mécanismes moléculaires précis impliqués dans l'excitotoxicité et accident vasculaire cérébral ischémique peut être difficile lors de l'utilisation des systèmes animaux entiers. En tant que tel, embryonnaire primaire et «neuronale comme '(par exemple neuroblastoma et adénocarcinome lignées immortalisées) des systèmes de culture de cellules sont souvent utilisés. Les principaux avantages de ces modèles est qu'ils sont faciles à manipuler, relativement rentable, et la mort cellulaire peuvent être facilement mesurés et quantifiés. Cependant, les voies de signalisation peuvent être modifiées par les conditions de culture utilisées, 3,4 et les neurones immatures et immortalisés lignes peuvent exprimer différents récepteurs et des molécules de signalisation par rapport à mûrir cerveau 5-8. En outre, des cultures de neurones permettent seulement l'examen d'un type de cellule (ou deux, si un système de co-culture est utilisée), tandis que le tissu cérébral intact est hétérogène, contenant une variété de types de cellules qui interagissent les uns avec les autres. Les systèmes de culture de tranches organotypiques minces (explants de tissu cérébral) sont également utilisés, et ces modèles permettent l'étude de populations hétérogènes de cellules tels qu'ils sont trouvés in vivo. Cependant, seule une quantité limitée de tissu peut être obtenue à partir de chaque animal pour l'utilisation de cette technique, des tranches peutpas être cultivées pendant aussi longtemps que des lignées cellulaires immortalisées, et au milieu de culture à long terme peut conduire à des altérations dans les voies de signalisation des récepteurs et dans les tranches. Alors que le cerveau adulte peut être utilisé pour générer des tranches organotypiques, tranches de cerveau immature se prêtent mieux à la culture, et sont le plus souvent utilisés. Il est donc nécessaire de développer des modèles qui imitent ou représentent cerveau mature intacte, qui sont faciles à utiliser, dans laquelle les voies de signalisation neuronales peuvent être examinées.
Ici, une technique in vitro portant sur des tissus nerveux intact qui peut être utilisé pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans la mort cellulaire suite à une insulte excitotoxique ou ischémique est décrite. Cette technique permet de réduire le nombre d'animaux requis pour effectuer une expérience, est reproductible, et génère des tissus viables qui se comporte d'une manière similaire à métaboliquement plus grandes tranches organotypiques. En outre, le circuit neuronal, les interactions cellulaires, et co postsynaptiquempartment reste partiellement intact. Le tampon physiologique utilisé permet les membranes cellulaires pour «refermeture», et permet aux cellules de retrouver leur résistance de la membrane d'origine 9. Ce modèle de tranche de cerveau est capable d'imiter fidèlement réponses observées suivant excitotoxicité médiée par des lésions cérébrales 10, et peut être utilisé pour examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans la course.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, une technique in vitro pour la génération de microslices qui peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l'excitotoxicité et de mort cellulaire médiée par l'ischémie dans un tissu de cerveau mature intact est décrite. Cette technique produit un tissu viable (figures 1-3), qui est métaboliquement semblable à de plus grandes tranches organotypiques 15. En outre, ce modèle de MicroSlice correspond étroitement à la répons…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds de recherche du Conseil national de la santé et de recherche médicale de l'Australie, le Hunter Medical Research Institute et l'Université de Newcastle.
Materials
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | Used to generate 100-400 μm brain sections. | ||
| McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | |||
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H. Practical Neurochemistry. , (1975).
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
