같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em> 체외</em> 스트로크의 모델
Summary
우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.
Abstract
전체 동물 체제를 사용하는 경우 허혈성 뇌졸중과 같은 신경 병리학 적 조건에 관련된 분자 메커니즘을, 검사, 어려울 수 있습니다. 예컨대, 기본 또는 '신경 조의'세포 배양 시스템은 일반적으로 이용된다. 이러한 시스템은 작동 비교적 용이하며, (예컨대 세포사와 같은) 다양한 기능적 결과를 쉽게 정량화 될 수있는 유용한 모델 시스템 (예 흥분 독성 – 매개 세포 사멸 경로 등) 배양 된 미숙 뉴런의 조사 결과와 경로이지만 반드시 성숙한 뇌에서 관찰 된 것과 같은, 또는 손상 조직에 없습니다. 따라서, 성숙한 신경 조직의 세포 메커니즘을 조사 할 수있는 모델을 개발할 필요가있다. 우리는 신경 조직 손상의 분자 경로의 다양성을 조사하기 위해 사용될 수있는 시험 관내 기술을 개발했다. 설명 된 기술은 본 명세서 쥐 대뇌 피질 조직을 활용하지만,이 기술은 조직을 사용하도록 구성 될 수있다또는 뇌 영역 (예를 들어, 해마, 선조체, 등) (예 : 마우스, 토끼, 기니 돼지, 닭 등) 종의 다양 한에서. 또한, 자극 / 치료의 다양한 (예를 들어, 흥분 독성, 억제제의 투여 등)을 사용할 수있다. 결론적으로, 본원에 기재된 뇌 슬라이스 모델 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘의 다양성을 조사 할 수있다.
Introduction
뇌졸중의 가장 일반적인 형태는 대뇌 혈관 폐색 될 때 발생하는 허혈성 뇌졸중이다. 혈액의 흐름 중단 한 결과 조직의 국소 빈혈은 세포막의 탈분극 확산, 흥분성 신경 전달 물질의 방출을 일으키고, 세포 죽음의 활성화에 이르게 세포 내 칼슘의 지속적인 상승은 1 경로. 이 과정은 '흥분 독성 (excitotoxicity)'라고하고, 스트로크 2 등의 병리의 다양한 의해 생성 된 신경 세포의 죽음에 관련된 일반적인 경로입니다되었습니다. 흥분 독성 및 다른 신경 세포 죽음의 계곡에 관련된 신호 전달 경로의 억제는 뇌졸중 다음 신경 세포의 손상을 제한 할 수있는 매력적인 방법입니다.
동물 전체 시스템을 사용할 때 흥분 독성 (excitotoxicity)과 허혈성 뇌졸중에 관련된 정확한 분자 메커니즘을 확인하는 것은 어려울 수 있습니다. 같은 차 배아와 '신경과 같은'(예를 들어 neuroblasto로엄마와 선암 불후의 선)는 세포 배양 시스템은 자주 사용된다. 이러한 모델의 주요 이점들은, 상대적으로 비용 효과적인 쉽게 조작 할 수 있으며 세포 사멸이 용이하고 정량 측정 할 수 있다는있다. 그러나, 신호 전달 경로는 배양 3,4를 사용 조건 및 미성숙 신경 세포에 의해 변경하고 선이 다른 수용체를 표현하고 뇌 5-8 성숙에 비해 신호 분자 수 불멸 할 수 있습니다. (공 배양 시스템이 사용되는 경우, 또는 2 개)의 손상 뇌 조직이 서로 상호 작용하는 다양한 종류의 세포를 함유하는 이종 반면 또한, 배양 된 신경 세포는 단지 하나의 세포 유형의 검사를 허용한다. Organotypic 슬라이스 배양 시스템 (뇌 조직의 얇은 절편)도 사용되며, 이들이 생체 내에서 발견되는 이러한 모델은 이종의 세포 집단의 연구를 허용한다. 이 기술을 사용하는 경우에는, 조직의 제한된 양 슬라이스는, 각각의 동물로부터 수득 할 수있다한 불후의 세포주로 배양 할, 장기 문화 매체는 슬라이스의 경로와 수용체 신호에 변화가 발생할 수 없습니다. 성숙한 두뇌의 Organotypic 조각을 생성하는 데 사용할 수있는 반면, 미성숙 뇌에서 슬라이스 문화에 더 많은 의무, 그리고 더 일반적으로 사용된다. 신경 신호 전달 경로를 검사 할 수있는 사용하기 쉬운 그대로 성숙한 뇌, 모방 또는 표현 모델을 개발하기 위해 필요하다.
여기서, 흥분 독성 또는 허혈성 모욕 다음 세포사에 관여 분자 메커니즘을 규명하는 데 사용할 수있는 손상 신경 조직을 포함하는 생체 외 기법을 설명한다. 이 기술은, 실험을 수행하는 데 필요한 동물의 수를 감소 재현이며, 더 큰 슬라이스의 Organotypic 대사 유사한 방식으로 동작 가능한 조직을 생성한다. 또한, 신경 회로, 셀룰러 상호 작용 및 시냅스 콜로라도mpartment 부분적으로 그대로 유지됩니다. 사용되는 생리 버퍼는 셀 '봉인'에 막, 그리고 수 세포가 원래의 막 저항 9를 복구 할 수 있습니다. 이 뇌 조각 모델을 충실하게 흥분 독성 매개 뇌 손상 10 다음 관찰 된 반응을 모방 할 수있다, 뇌졸중에 관련된 분자 메커니즘을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 본래 성숙한 뇌 조직에서 흥분 독성 및 허혈 – 매개 세포 사멸에 관여하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수 microslices의 생성을위한 시험 관내 기술이 설명된다. 이 기술은 실행 가능한 조직 (1-3 피규어), 즉 큰의 Organotypic 조각 15 대사와 유사하다을 생산하고 있습니다. 또한,이 microslice 모델은 밀접하게 생체 내 10 흥분 독성 매개 뇌 손상 다?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회, 헌터 의학 연구소, 뉴캐슬 대학에서 연구 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | Used to generate 100-400 μm brain sections. | ||
| McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | |||
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
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