Analysere proteasomal Nedsatt en Cell-free systemet i planter
Summary
Målrettet protein degradering representerer en viktig reguleringsmekanisme for cellefunksjon. Det skjer via en konservert Ubiquitin-proteasom, som festes polyubiquitin kjedene til målet protein som deretter tjene som molekylære "koder" for 26S proteasomet. Her beskrives en enkel og pålitelig cellefritt assay for proteasomal degradering av proteiner.
Abstract
Den ubiquitin-proteasom svei for proteinnedbrytning har dukket opp som en av de viktige mekanismer for regulering av et vidt spektrum av cellulære funksjoner i praktisk talt alle eukaryote organismer. Nærmere bestemt, i planter, er ubiquitin/26S proteasom system (UPS) regulerer proteinnedbrytning og bidrar vesentlig til utvikling av en rekke prosesser, inkludert immunrespons, utvikling og programmert celledød. Videre antyder at mange plantepatogener, for eksempel Agrobacterium, utnytte verts UPS for effektiv infeksjon, understreker viktigheten av UPS i plante-patogen interaksjoner økende bevis.
Underlaget spesifisitet av UPS oppnås ved E3 ubiquitin ligase som fungerer på konsert med E1 og E2 ligaser å gjenkjenne og merke bestemte proteinmolekyler bestemt for degradering ved å feste dem kjeder av ubiquitin molekyler. En klasse av de E3 ligaser i SCF (Skp1 / CUllin / F-box protein) kompleks, som spesifikt gjenkjenner UPS underlag og mål dem for ubiquitinering via sin F-box protein komponent. For å undersøke en mulig rolle for UPS i en biologisk prosess av interesse, er det viktig at man har en enkel og pålitelig test for UPS-mediert proteinnedbrytning. Her beskriver vi ett slikt assay ved hjelp av en plantecellefritt system. Denne analysen kan tilpasses for studier av rollene som regulerte protein nedbrytning i ulike cellulære prosesser, med et spesielt fokus på F-boks protein-substrat interaksjoner.
Introduction
Den ubiquitin/26S proteasom vei fremstår som en utbredt mekanisme for kontroll av ulike biologiske reaksjoner, inkludert transkripsjonsregulering, celle-syklus progresjon og signaltransduksjon, reseptor nedregulering eller endocytose, blant andre behandler 1-4. I denne veien, blir målproteinet tagget av ubiquitin rester som er først festet via en thiolester bindingen til ubiquitin-aktiverende enzym E1 og deretter translocated til et cystein aminosyrerest av ubiquitin-konjugering enzym E2, og endelig, vekselvirker med ubiquitin ligase E3 E2 , noe som resulterer i polyubiquitination av protein-substrat. Til syvende og sist, er de polyubiquitinated proteiner anerkjent og forringes av 26S proteasomet. I denne mekanismen, angir E3 enzymet substratet og fungerer som en nøkkel reguleringskomponent i ubiquitin/26S proteasom system (UPS). E3 ligaser kan opptre uavhengig av hverandre, slik som RING domain ligaser, eller som del av en multisubunit SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) komplekse, for eksempel F-boks domene ligaser. SCF-medierte proteasomal nedbrytningsmekanismer er involvert i regulering av transkripsjon, cellesyklus, signaltransduksjon 5-10 og mange andre store cellulære funksjoner.
Foruten disse kritiske roller i regulering av cellulære prosesser, tar UPS den sentrale scenen i mange plante-patogen interaksjoner. For eksempel, antyder økende bevis for at flere plante patogener, inkludert Agrobacterium tumefaciens, er avhengige av verts UPS for å lette infeksjonen prosessen 11. Agrobacterium utløser neoplastiske utvekster på planter, som hver representerer dens naturlige verter, og det kan også transformere en rekke andre eukaryoter, fra sopp 1,2 til menneskeceller 12,13. I løpet av sin infeksjon, Agrobacterium eksporterer et DNA-element (T-DNA) og flere virulens (Vir) proteiner i vertscellen 12-13. Et av disse proteiner er VirF, den første F-boks protein funnetå bli kodet av en prokaryotisk 14 genome. Som en del av SCF ubiquitin ligase kompleks, VirF, og dens funksjonelle verts homolog VBF 15, legge til rette for Agrobacterium-infeksjon via UPS-mediert proteinnedbrytning, som antagelig letter avkapsling av den invaderende bakterie-T-DNA fra tilhørende bakterie-og vert proteiner, VirE2 og VIP1, henholdsvis 16,17. Interessant nok mange F-boks proteiner, inkludert VirF, er egentlig ustabile på grunn av deres egen proteolyse, som blir mediert av autoubiquitination aktivitet 18,19 eller på annen E3 ligaser hvor F-boks proteiner kan tjene som substrater 20-23.
Ved å studere biokjemiske aktiviteter av F-boks proteiner, andre ubiquitin ligaser, og / eller deres underlag, ville det være svært nyttig å benytte en enkel og pålitelig test for proteasomal degradering. Her beskriver vi en slik protokoll for analyse av proteinstabilitet i en celleFritt system. I denne analyse, er stabiliteten til UPS substrat analyseres i nærvær eller fravær av en av de grunnleggende komponenter i proteasomal nedbrytningsveien, slik som en F-box protein, i et cellefritt system. Generelt kan vi uttrykke den testede protein (er) i plantemateriale, forberede cellefrie ekstrakter av disse vev og overvåke de mengder av protein (er) av interesse ved western blotting. UPS-avhengig mekanisme for proteindegradering er demonstrert ved inkludering av spesifikke proteasomal-inhibitorer og / eller ved hjelp av coexpression av dominant-negative form av en SCF-komponent, Cullin. Mens vi illustrere dette assay ved å bruke proteasomal nedbrytning av Arabidopsis VIP1 17 protein av F-protein VBF boksen 15, kan det bli anvendt for å undersøke stabiliteten av eventuelle andre proteasomal substrater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne analysen er avhengig av ekspresjonen av de testede proteiner i plantemateriale, og derfor den potensielle proteasomal nedbrytingsprosessen åpenbart skjer allerede i løpet av de levende vev. Vi analysen protein destabilisering imidlertid bare i ekstraktene, med tiden null-prøven som tjener som det første referansepunkt. Derfor kan vi definere det som et cellefritt assay.
Et viktig aspekt for suksess for denne analyse er det riktige valg av ekspresjonsvektoren for den testede protein…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet fører til denne publikasjonen har fått støtte fra Marie Curie COFUND programmet "U-Mobility", cofinanced ved Universitetet i Malaga og EU 7. rammeprogram (FP7/2007-2013) i henhold GA nr. 246550. Arbeidet i vårt laboratorium er støttet med tilskudd fra NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, og BSF til VC
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Ausobel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
