يعاير Proteasomal تدهور في نظام خالية من الخلايا في النباتات
Summary
يمثل استهداف تدهور البروتين آلية تنظيمية كبرى لوظيفة الخلية. يحدث عبر اليوبيكويتين proteasome ومسار الحفظ، والتي تعلق سلاسل polyubiquitin للبروتين الهدف الذي ثم خدمة "العلامات" الجزيئية بالنسبة للproteasome و26S. هنا، نحن تصف مقايسة خالية من الخلايا بسيطة وموثوق بها لتدهور proteasomal البروتينات.
Abstract
برز مسار اليوبيكويتين-proteasome وعن تدهور البروتين باعتباره واحدا من أهم الآليات لتنظيم مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية في جميع الكائنات الحية حقيقية النواة تقريبا. على وجه التحديد، في النباتات، ونظام proteasome وubiquitin/26S (يو بي إس) ينظم تدهور البروتين ويساهم بشكل كبير في تطوير مجموعة واسعة من العمليات، بما في ذلك الاستجابة المناعية والتنمية وموت الخلية المبرمج. علاوة على ذلك، تشير أدلة متزايدة على أن العديد من مسببات الأمراض النباتية، مثل الأجرعية، استغلال UPS المضيفة للعدوى كفاءة، مع التشديد على أهمية يو بي إس في التفاعلات النبات الممرض.
ويتحقق خصوصية ركيزة من يو بي إس من قبل اليوبيكويتين يغاز E3 الذي يعمل بالتنسيق مع E1 و E2 ligases الاعتراف وعلامة جزيئات البروتين محددة متجهة إلى التدهور عن طريق ربط لهم سلاسل من جزيئات اليوبيكويتين. فئة واحدة من ligases E3 هو SCF (Skp1 / Cالبروتين ullin / F-مربع) المعقدة، التي تعترف تحديدا ركائز يو بي اس ويستهدف لهم لubiquitination عبر عنصر البروتين F-علبته. للتحقيق في الدور المحتمل لليو بي إس في عملية بيولوجية من الفائدة، فمن المهم وضع مقايسة بسيطة وموثوق بها لUPS بوساطة تدهور البروتين. هنا، نحن تصف إحدى هذه مقايسة باستخدام نظام خالية من الخلايا النباتية. هذا الاختبار يمكن تكييفها للدراسات أدوار تدهور البروتين في تنظيم العمليات الخلوية المتنوعة، مع التركيز بشكل خاص على F-مربع البروتين الركيزة التفاعلات.
Introduction
وproteasome ومسار ubiquitin/26S والناشئة باعتبارها آلية على نطاق واسع من أجل السيطرة على التفاعلات البيولوجية المتنوعة، بما في ذلك تنظيم النسخي، خلية دورة التقدم ونقل الإشارة، مستقبلات أسفل تنظيم أو الإلتقام، من بين أمور أخرى بمعالجة 1-4. في هذا المسار، والموسومة البروتين الهدف عن طريق اليوبيكويتين المخلفات التي تعلق الأول عن طريق السندات thiolester لانزيم تفعيل اليوبيكويتين E1 ثم translocated إلى بقايا حمض السيستين الأميني الانزيم اليوبيكويتين-E2 الاقتران، وأخيرا، يتفاعل مع اليوبيكويتين E2 E3 يغاز ، مما أدى إلى polyubiquitination الركيزة البروتين. في نهاية المطاف، يتم التعرف على البروتينات polyubiquitinated والمتدهورة التي proteasome و26S. في هذه الآلية، يحدد الإنزيم E3 الركيزة وتقوم بدور العنصر التنظيمية الرئيسية لنظام proteasome وubiquitin/26S (يو بي إس). يمكن ligases E3 التصرف بشكل مستقل، مثل ligases مجال RING، أو كجزء من SCF multisubunit (Skp1/Cullin/F-box البروتين) المعقدة، مثل ligases مجال F-مربع. وتشارك SCF بوساطة مسارات التحلل proteasomal في تنظيم النسخ، ودورة الخلية، نقل الإشارة 5-10 والعديد من الوظائف الخلوية الرئيسية الأخرى.
إلى جانب هذه الأدوار الحاسمة في تنظيم العمليات الخلوية، يو بي إس يأخذ مرحلة مركزية في كثير من التفاعلات النبات الممرض. على سبيل المثال، تشير أدلة متزايدة على أن العديد من مسببات الأمراض النباتية، بما في ذلك الأجرعية المورمة، والاعتماد على UPS المضيفة لتسهيل عملية العدوى 11. الأجرعية يتسبب نمو الأورام على النباتات، والتي تمثل المضيفين الطبيعية، ويمكن أيضا تحويل مجموعة واسعة من حقيقيات النوى الأخرى، من الفطريات 1،2 إلى الخلايا البشرية 12،13. أثناء الإصابة به، الأجرعية تصدر عنصر الحمض النووي (T-DNA) والعديد من الفوعة (فير) البروتينات في الخلية المضيفة 12-13. واحدة من هذه البروتينات هو VirF، أول بروتين F-مربع جدتأن المشفرة بواسطة الجينوم بدائية النواة 14. كجزء من مجمع SCF اليوبيكويتين يغاز، VirF، وجانه الفنية homolog المضيف VBF 15، وتسهيل عدوى الأجرعية عبر شركة يو بي إس تدهور البروتين بوساطة، مما يسهل يفترض uncoating من البكتيريا T-DNA الغازية من المرافق البروتينات في البكتيريا والمضيف، VirE2 وVIP1، على التوالي 16،17. ومن المثير للاهتمام، وكثير من البروتينات F-مربع، بما في ذلك VirF، هي في جوهرها غير مستقرة بسبب التحلل البروتيني الخاصة بهم، والتي يتم بوساطة النشاط autoubiquitination 18،19 أو ligases E3 الأخرى التي البروتينات F-مربع قد تكون بمثابة ركائز 20-23.
عند دراسة الأنشطة البيوكيميائية للبروتينات F-مربع، ligases اليوبيكويتين أخرى، و / أو ركائز، وسيكون من المفيد جدا لتوظيف مقايسة بسيطة وموثوق بها لتدهور proteasomal. نحن هنا وصف بروتوكول واحد مثل لتحليل استقرار البروتين في الخليةخالية النظام. في هذا الاختبار، ويتم تحليل استقرار الركيزة يو بي إس في وجود أو عدم وجود واحدة من المكونات الأساسية للتدهور مسار proteasomal، مثل البروتين F-مربع، في نظام خالية من الخلايا. عموما، فإننا نعرب عن البروتين اختبار (ق) في أنسجة النبات، وإعداد مقتطفات خالية من الخلايا من هذه الأنسجة ورصد كميات من البروتين (ق) من الفائدة عن طريق النشاف الغربية. ويتجلى آلية تعتمد على UPS تدهور البروتين عن طريق إدراج مثبطات proteasomal محددة و / أو استخدام coexpression من الشكل السائد السلبية من عنصر SCF، Cullin. بينما نحن لتوضيح هذا الاختبار باستخدام تدهور proteasomal من البروتين نبات الأرابيدوبسيس VIP1 17 من البروتين F-مربع VBF 15، قد تكون استخدمت لتحقيق استقرار أي ركائز proteasomal الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد هذا الاختبار على التعبير عن البروتينات اختبار في الأنسجة النباتية، وبالتالي، فإن عملية تدهور proteasomal المحتملة الواضح يحدث بالفعل داخل الأنسجة الحية. نحن فحص البروتين زعزعة الاستقرار، ولكن فقط في مقتطفات، مع الوقت عينة الصفر العامل بوصفه نقطة مرجعية أولية. ومن …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقت عمل يؤدي إلى هذا المنشور بتمويل من برنامج ماري كوري COFUND "U-التنقل"، تمويله من قبل جامعة ملقة والبرنامج الإطاري الاتحاد الأوروبي ال 7 (FP7/2007-2013) تحت رقم 246550 GA. ويدعم عمل في مختبرنا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، وزارة الزراعة / NIFA، جبهة الخلاص الوطني، BARD، والبنك السعودي الفرنسي لVC
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Ausobel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
